超高效液相色谱-串联质谱法同时测定知母药材中8种植物生长调节剂的残留量*

黄晓婧，曾桢，肖春霞，许莉，李庆，赵小勤

(成都市药品检验研究院/中药材质量监测评价重点实验室，成都 610045)

中医药具有几千年的悠久历史，是中华民族的宝贵财富[1]。人口的增加及中医药的发展导致对中药材的需求量不断增加，野生资源的过度开发也造成了中药资源的严重短缺。中药栽培作为一个新兴的产业应运而生，并逐渐走向了规模化[2]。植物生长调节剂为人工合成的对植物生长发育有调节作用的化学物质，能有效调节植物的生长发育过程，达到稳产增产、改善品质、增强植物抗逆性等目的[3]。植物生长调节剂在农林果蔬园艺等领域已广泛使用，其可以显著缩短生长年限并增加产量，在药用植物种植中的应用研究始于20世纪80年代末[4]，集中于根及根茎类药材，如应用在丹参[5]、川白芷[6]、麦冬[7]等品种上，以提高产量。但在增产的同时也具有一定的毒性，如赤霉素可能增加皮肤和膀胱慢性炎症的发生[8]，多效唑原药在一定剂量时可导致繁殖毒性[9]。也有研究表明，植物生长调节剂会使党参有效成分党参炔苷含量降低[10]。

知母为百合科植物知母(AnemarrhenaasphodeloidesBge.)干燥根茎，主要化学成分包括甾体皂苷、木质素、黄酮等[11]，具有抗肿瘤、抗炎、改善老年痴呆、改善骨质疏松等作用[12]。目前，对知母的研究主要集中在有效成分及药理方面，笔者未见检测知母中植物生长调节剂的报道。本研究针对根茎类常用的8种植物生长调节剂，采用超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)技术建立其在知母中的含量检测方法，以期为知母生产过程中质量控制和安全性检测提供参考。

1 仪器与试药

1.1仪器 Agilent 1290型超高效液相色谱串联6470三重四级杆质谱联用仪(UPLC-MS/MS，美国安捷伦公司)；AUX220型电子天平(日本岛津公司，感量：0.001 mg)；XPE26型电子天平(梅特勒-托尼多仪器有限公司，感量：0.001 mg)；SK250H型超声波清洗器(250 W，53 kHz，上海科导超声仪器有限公司)。

1.2药品与试剂 丁酰肼(批号：20927，含量：97.0%)、矮壮素(批号：111686，含量：99.0%)、助壮素(批号：112950，含量：99.0%)、4-硝基苯酚钠(批号：30320，含量：92.9%)、氯吡脲(批号：109007，含量：99.2%)对照品均购于德国Dr.Ehrenstorfer公司，赤霉素(批号：20170324，含量：99.2%)、多效唑(批号：20170616，含量：99.4%)、烯效唑(批号：20160311，含量：99.8%)对照品均购于上海市农药研究所有限公司。

试剂：乙腈(德国Merck公司，色谱纯)；甲酸铵(美国Fisher公司，质谱级)；水为娃哈哈纯净水，其余试剂为分析纯。

30批次知母样品(编号s1～s30)，经成都市食品药品检验研究院周世玉主任中药师鉴定，为百合科知母(AnemarrhenaasphodeloidesBge.)的干燥根茎，样品信息见表1。

表1 知母样品信息

2 方法与结果

2.1溶液的制备

2.1.1混合对照品溶液 分别精密称取丁酰肼、矮壮素、助壮素、赤霉素、4-硝基苯酚钠、氯吡脲、多效唑、烯效唑对照品各约10 mg，置于10 mL量瓶，加乙腈溶解定容，制成约1 mg·mL-1单标储备液，储存于-20 ℃冰箱。再用乙腈稀释配制成1 μg·mL-1混合对照品溶液，于棕色量瓶保存(12 h内使用)。

2.1.2供试品溶液 精密称取知母样品粉末(过三号筛，筛孔内径355 μm)3 g，置50 mL具塞离心管，加入含0.1%甲酸的乙腈提取液20 mL，涡旋混匀30 s，超声处理20 min，4000 r·min-1离心10 min(r=60 mm)，静置，取上清液。加乙腈10 mL，同法提取1次，合并上清液。于40 ℃氮气吹至1～2 mL，加50%乙腈定容至10 mL，用孔径0.22 μm滤膜滤过，即得。

2.1.3空白对照 在不加样品的情况下，同“2.1.2”项操作，得空白对照溶液。

2.2色谱条件 色谱柱：Waters ACQUITY UPLC HSST3(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)；流动相：5 mmol·L-1甲酸铵溶液(流动相A)-乙腈(流动相B)，梯度洗脱，0～2 min，98%A；2～3 min，98%A→65%A；3～6 min，65%A→60%A；6～10 min，60%A→15%A；10～11 min，15%A→10%A；流速：0.3 mL·min-1；柱温：30 ℃；进样量：1 μL。

2.3质谱条件 离子源：电喷雾(electrospray ionization，ESI)；扫描方式：正、负离子同时扫描；检测方式：多反应监测(multiple reaction monitoring，MRM)，毛细管电压：4000 V(正离子模式)；3500 V(负离子模式)；气体温度：350 ℃；气体流速：10 L·min-1；8种植物生长调节剂质谱分析条件见表2，倍增管电压(electron multiplier voltage ，EMV)分段条件见表3。 在上述色谱条件下，对照品溶液、样品溶液和空白对照溶液总离子流图见图1～3。MRM离子流图见图4。

表2 8种植物生长调节剂质谱分析参数

表3 质谱分段电压

1.丁酰肼；2.矮壮素；3.助壮素；4.赤霉素；5.4-硝基苯酚钠；6.氯吡脲；7.多效唑；8.烯效唑。

图2 知母样品总离子流图

图3 空白对照总离子流图

2.4线性关系考察 取未检出8种植物生长调节剂的知母样品，同“2.1.2”项下操作，制成空白基质提取液。采用空白基质提取液，将“2.1.1”项混合对照溶液稀释成浓度分别为1000，500，100，50，10，1，0.5，0.1，0.02 ng·mL-1溶液，按“2.2”“2.3”项实验条件分析，以浓度为横坐标、定量离子对峰面积为纵坐标，进行线性回归。结果见表4。

图4 8种植物生长调节剂多反应监测离子流图

表4 8种植物生长调节剂线性范围、检出限和定量限测定结果

2.5定量限与检测限考察 精密量取“2.1.1”项混合对照品溶液，以乙腈倍比稀释，再按“2.2”“2.3”项条件连续进样测定6次，记录峰面积。当信噪比为 3：1，10：1时分别得检测限、定量限。结果见表4。

2.6精密度实验 取“2.4”项50 ng·mL-1混合对照品溶液，按“2.2”“2.3”项实验条件连续进样6次，记录峰面积。结果丁酰肼、矮壮素、助壮素、赤霉素、4-硝基苯酚钠、氯吡脲、多效唑、烯效唑峰面积RSD分别为1.74%，2.73%，2.73%，2.39%，1.49%，3.13%，2.05%，2.56%(n=6)。表明该仪器精密度良好。

2.7稳定性实验 精密吸取“2.6”项混合对照品溶液，于室温下放置0，2，4，6，8，12 h，按“2.2”“2.3”项实验条件进行分析，测定峰面积。结果丁酰肼、矮壮素、助壮素、赤霉素、4-硝基苯酚钠、氯吡脲、多效唑、烯效唑峰面积RSD分别为1.35%，1.88%，2.12%，1.89%，1.33%，2.06%，2.15%，2.11%(n=6)。表明对照品溶液在12 h内稳定。

2.8加样回收率实验 精密称取未检测出植物生长调节剂的知母样品1.5 g，共6份，分别加入混合对照品溶液1 mL(浓度10 ng·mL-1)，按“2.1.2”项方法制备供试品溶液，按“2.2”“2.3”项实验条件进行分析，记录峰面并计算加样回收率，结果见表5。

表5 8种植物生长调节剂加样回收率实验结果

续表5 8种植物生长调节剂加样回收率实验结果

2.9含量测定结果 取30批次知母样品，按照“2.1.2”项下供试品溶液制备方法制备，按照“2.2”“2.3”项方法进样，结果s2批次矮壮素含量为6.3 μg·kg-1，s26批次矮壮素含量为3.8 μg·kg-1。其余批次均未检出。

3 讨论

3.1色谱条件优化 本研究考察了不同色谱柱对多成分的分离效果和峰形影响。对比了Agilent Eclipse plus C18RRHD(2.1 mm×50 mm，1.8 μm)、Waters ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)、Waters ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)，8种待测组分性质差异较大，矮壮素、助壮素、丁酰肼极性较大，T3作为一种亲水性色谱柱，对这3种成分的分离效果更好，但4-硝基苯酚钠峰形较差。综合考虑8种成分的分离效果及峰形，最终选择Waters ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱。

液相色谱-质谱联用仪中，流动相通常使用乙腈作为有机相[13]，为增加离子化效率通常在水相中添加一定浓度甲酸、甲酸铵或乙酸铵等。笔者在本实验考察了0.1%甲酸、5 mmol·L-1甲酸铵-0.1%甲酸、5 mmol·L-1甲酸铵溶液和5 mmol·L-1乙酸铵溶液。结果5 mmol·L-1甲酸铵溶液比加入了甲酸的流动相对赤霉素、氯吡脲的响应更高，4-硝基苯酚钠的响应稍低，由于赤霉素是响应值最低的成分，所以以其为参照最终选取5 mmol·L-1甲酸铵-乙腈作为流动相。

3.2质谱条件的优化 取混合对照品溶液(50 ng·mL-1)进样，自动优化离子源参数。由于赤霉素和4-硝基苯酚钠是负模式，响应值较低，进行了分段，在第二段加电压300 V。

3.3提取方式的选择 本研究同时考察QuEChERS方法，该法是一种快速、简便的净化方法，已被广泛应用于食品中植物生长激素的前处理[14-15]。笔者在本实验精密称取知母粉末3 g，采用含有无水硫酸镁、N-丙基乙二胺固相吸附剂、C18、石墨化炭黑的盐包进行净化。实验结果表明丁酰肼、矮壮素、助壮素回收率较低，无法达到分析要求。采用溶剂提取后直接进样，回收率可达70%，干扰较少且操作简便。

3.4结果分析 目前通行的植物生长调节剂限量标准主要有4个：欧盟标准、国际食品法典委员会标准、日本标准、美国标准[16-17]。我国农药类标准逐步细化完善，现行有效标准是GB.2763-2016，目前我国规定小麦、玉米、棉籽中矮壮素最高残留量分别为5，5，0.5 mg·kg-1，日本规定茶叶中矮壮素最低残留限量0.5 mg·kg-1，欧盟委员会规定矮壮素最低残留限量为0.1 mg·kg-1，但均未对中药饮片中残留限量做出明确规定。参考以上限度规定，检出样品矮壮素含量较低，处于安全范围内。

3.5完善植物生长调节剂残留标准的建议 近年来，植物生长调节剂在中药材种植中被广泛应用，但其对中药材质量的影响复杂，也缺乏大量的相关安全性有效性研究。部分药农为追求高产量高效益，在中药材种植过程中往往过量使用和不当使用。为实现有效监管，有必要对不同类别植物生长调节剂在中药材中的残留量带来的安全性和有效性进行风险评估，分等级完善残留量标准，科学指导药农合理应用，在安全范围内增产增效。