盐度、温度和光照对广西沿海牟氏角毛藻生长的影响

朱昔恩，林原有，项桂德，熊建华，陈田聪，陈晓汉，张 彬

（广西水产科学研究院/广西水产遗传育种与健康养殖重点实验室，广西 南宁 530021）

【研究意义】牟氏角毛藻可作为对虾幼体培育的高营养优质生物饵料［1］，而且由于该藻可利用海水养殖中的代谢物N、P，因此可降低养殖水体中氨氮和磷酸盐的浓度，从而改善和维持良好的养殖生态系统［2-3］。广西沿海防城港海区是浮游藻类密集区，富含尖刺拟菱形藻、拟旋链角毛藻等［4］。本研究结合广西沿海防城港海区的气候和水质条件，探讨牟氏角毛藻生长的适宜条件，为规模化培育提供参考。【前人研究进展】目前，已有较多对牟氏角毛藻规模化培育环境因子的相关研究［5-6］。Elizerberth 等［1］研究了盐度、温度、光照周期与强度对牟氏角毛藻营养吸收和生物量产生的影响；班剑娇等［7］研究认为，盐度20‰时牟氏角毛藻生长最佳；孟天等［8］研究了温度和光照强度等对牟氏角毛藻生长的影响；曾蓓蓓等［9］认为牟氏角毛藻的生长受温度、盐度、光照强度等因子的交互作用影响；Tasneema 等［10］在盐度逐渐增加的条件下，开展了联合和分步培养牟氏角毛藻生产岩藻黄素的研究；栾会妮等［11］研究发现，一些耐高温角毛藻在试验设置的不同盐度、温度和光照梯度下均能生长，具有广温、广盐和广光照的特性，可适应高温和高盐；骆云慧等［12］对浮游植物群落结构与水质因子进行典型对应分析，认为硅藻门种群变化主要与温度、盐度、pH 密切相关，牟氏角毛藻在凡纳滨对虾生态养殖初期和后期均为优势种。但由于藻种来源及所处地域气候环境的差异，上述文献报道的结果差异显著，表明环境因子对藻类的生长影响显著。【本研究切入点】牟氏角毛藻属于海洋浮游硅藻，具有广盐、广温、繁殖快、营养丰富等优点，是虾蟹贝类幼体培育的优质饵料，较多文献报道显示，受藻种来源和区域气候水质环境等影响，不同环境因子对牟氏角毛藻的生长影响存在较大差异。本研究结合广西防城港海区气候和水质等因素［4，13］探讨高效培育牟氏角毛藻的适宜环境因子。【拟解决的关键问题】本研究通过设置不同盐度、温度、光照强度等环境因子开展研究，筛选获得在广西沿海区域实现稳定高效培育牟氏角毛藻的适宜条件，为其规模化培育生产提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

牟氏角毛藻藻种于2019 年7 月从广西防城港市港口区企沙镇玉石滩近岸海水中分离得到，并由广西水产科学研究院海水藻种室纯化保种。培养基配方如下：75 mg/L 硝酸钠、5 mg/L 磷酸二氢钾、30 mg/L 硅酸钠、3.9 mg/L 柠檬酸铁、0.178 mg/L 氯化锰、1 μg/L 硫酸铜、23 μg/L 硫酸锌、7.3 μg/L 钼酸钠、12 μg/L 氯化钴、4.35 μg/L EDTA-二钠、0.1 mg/L 维生素B1、0.5 μg/L 维生素B12，以上试剂均为分析纯。

1.2 藻类培养与试验设计

2020 年6 月，按上述配方进行牟氏角毛藻藻种接种扩繁，连续扩培至指数生长期。取20 mL指数生长期的牟氏角毛藻藻液至含有200 mL 营养液的玻璃锥形瓶中，置于光照培养架上培养，pH 8.0±0.1，光暗周期L∶D=12 h∶12 h，培养期间每天定时摇晃2 次锥形瓶，随机更换锥形瓶位置减少光照差异，每个因子设置3 个重复。培养10 d 后测定藻数量。各试验梯度设计如下：盐度试验设置0‰、低盐处理（5‰、10‰）、中盐处理（20‰、30‰）、高盐度处理（35‰、40‰）等7 个梯度，温度25（±1）℃、光照强4 000 lx；温度试验设置25、28、31、34 ℃等4个梯度，盐度20‰、光照强度4 000 lx；光照强度试验设置1 000、4 000、7 000 lx 等3 个梯度，盐度20‰、温度25（±1）℃。

1.3 指标测定

试验期间，每天定时测定藻细胞浓度，采用XB-K-25 血球计数板在显微镜（Nikon ECLIPSE-E100）下计数，每个样品计数3 次。计算生长速率（K）：

K（%）=（lnNt-lnN0/t）×100

式中，Nt是培养第t 天的藻细胞密度，N0为初始藻细胞密度，t 为培养天数。

利用Excel 软件进行图表制作，采用SPSS22.0 软件对数据进行平均值和标准差计算以及单因素方差分析，若组间差异显著，则作Duncan’s多重比较分析。

2 结果与分析

2.1 盐度对牟氏角毛藻生长的影响

由图1 可知，牟氏角毛藻在5‰～40‰盐度条件下均能生长，0‰盐度条件下生长缓慢，且与其他盐度处理差异显著，中盐度处理（20‰～30‰）藻细胞密度最高，低盐度处理（5‰～10‰）次之，高盐度处理（35‰～40‰）藻细胞密度最小，且生长速度最慢。表1 显示，中盐度处理（20‰～30‰）的生长速度和藻细胞密度均达到最高，两者增长速率差异不显著，但盐度20‰的藻体保持活性周期较长，藻细胞密度最大，略优于30‰盐度，为最佳盐度。低盐度处理（5‰～10‰）和高盐度处理（35‰～40‰）的藻细胞密度和生长速率在各个生长时期差异均不明显。

图1 不同盐度下牟氏角毛藻的生长曲线Fig.1 Growth curves of Chaetoceros muelleri at different salinity

表1 不同盐度下牟氏角毛藻生长期的最大藻细胞密度和生长速率Table 1 Maximum algal cell density and growth rate of Chaetoceros muelleri at different salinity

2.2 温度对牟氏角毛藻生长的影响

由图2 可知，牟氏角毛藻培育的最佳温度是31 ℃，该温度下4 d 后藻细胞密度达到峰值6.975×106cell/mL，之后缓慢死亡；而34 ℃下3 d 后藻细胞密度达到峰值6.371×106cell/mL，维持2 d 后迅速死亡；此外，28 ℃下4 d 后藻细胞密度达到峰值5.9×106cell/mL，随后进入消亡期；25 ℃下6 d 后藻细胞密度达到峰值4.492×106cell/mL，其藻细胞密度最小，但稳定期时间最长。表2 显示，不同温度下牟氏角毛藻的生长速度差异显著，其中温度与生长速率呈正相关，而最大藻细胞密度在31℃下最高，34℃温度组次之，均显著高于25、28℃温度处理。

图2 不同温度下牟氏角毛藻的生长曲线Fig.2 Growth curves of Chaetoceros muelleri at different temperatures

表2 不同温度下牟氏角毛藻生长期的最大藻细胞密度和生长速率Table 2 Maximum algal cell density and growth rate of Chaetoceros muelleri at different temperatures

2.3 光照强度对牟氏角毛藻生长的影响

由图3 可知，牟氏角毛藻生长所需的最佳光照强度是4 000 lx，在该光照强度下藻细胞密度显著高于其他处理；而在1 000 lx 和7 000 lx 下生长相对缓慢，前3 d 各处理均处于指数生长期，呈上升趋势，4～5 d 后藻细胞浓度达到峰值，但藻细胞密度短暂稳定后进入衰亡期，其中1 000 lx 处理的藻细胞衰亡速度显著高于其他处理。表3 显示，牟氏角毛藻在4 000 lx 光照强度下的生长速率和最大藻细胞密度均显著高于1 000 lx 和7 000 lx处理。

图3 不同光照强度下牟氏角毛藻的生长曲线Fig.3 Growth curves of Chaetoceros muelleri at different light intensity

表3 不同光照强度下牟氏角毛藻生长期的最大藻细胞密度和生长速率Table 3 Maximum algal cell density and growth rate of Chaetoceros muelleri at different light intensity

3 讨论

盐度对海水养殖生物的渗透压、生长、发育等影响显著，盐度变化对海洋微藻的生长和生理反应同样产生较大影响［14-15］。本研究结果表明，牟氏角毛藻在5‰～40‰盐度条件下均能生长，但综合生长速度、藻细胞密度、指数生长期稳定时长和衰亡速度等指标参数，中盐度处理（20‰～30‰）是牟氏角毛藻稳定培养的适宜盐度范围，其中最适盐度为20‰。张平等［14］研究认为，21‰～26‰盐度范围内角毛藻的藻细胞生长速度较快，与本研究结果一致。班剑娇等［7］报道，20（±1）‰盐度条件下牟氏角毛藻的藻细胞浓度和生长速率均表现最佳，与本研究结果得到的最适盐度值20‰相一致。此外，一些报道也显示角毛藻生长的适合盐度范围为10‰～30‰［9，16-17］，表明不同种类及分布海域的差异也会导致角毛藻对盐度的适应性存在一定差异。此外我们在试验中观察发现，0‰盐度处理的牟氏角毛藻前3 d 就出现部分死藻，之后出现持续增长的现象，推测可能是该藻通过较长时间的低盐环境驯化及调整自身生长生理状态，逐步适应了淡水环境而部分恢复增殖生长。

温度是影响海洋单胞微藻生长和繁殖最重要的生态因子之一，其对酶的活性、营养物的吸收及细胞分裂周期等均产生较大影响［18-20］。本研究中广西沿海防城港海区牟氏角毛藻在25～34 ℃范围内均能正常生长繁殖，其适宜生长温度范围为28～31 ℃，最适生长温度是31℃，属于耐高温的海洋微藻，这与文献［8，11］报道的角毛藻具有耐高温特性的结果一致。但温度波动频率和幅度越大对牟氏角毛藻的生长速率和藻细胞密度越不利。此外，本研究发现，在适宜温度范围外的低温（25 ℃）条件，牟氏角毛藻呈现缓慢生长状态，而当温度升至适宜温度时随即迅速恢复生长，推测可能是低温对牟氏角毛藻生长产生了短暂的抑制效应，这一分析与茅华等［17］的研究结论相一致。

光照强度对海洋微藻的生长速率和繁殖也起到至关重要的作用［21］。多数海洋微藻对光能有相同的适应生理，对光照强度有一个光饱和点。低于光饱和点时，随着光照强度增加，生长速率增加；高于光饱和点时，生长速率减慢［22-23］，这种变化趋势与本研究结果类似。本研究表明，牟氏角毛藻生长的最适光照强度为4 000 lx，培养3 d 后藻细胞密度达到峰值；孟天等［8］研究认为，10 000 lx 为牟氏角毛藻生长的最适光照强度，历时12 d 达到最大藻细胞密度，这与本研究结果存在差异，而茅华等［17］认为，旋链角毛藻在4 000 lx 条件下生长最好，与本研究中牟氏角毛藻的最适光照强度相一致。分析上述研究结果的差异，这是因为环境因子间存在交互作用［24］，同种微藻的生长存在一定差异，而同属不同种间又存在一定相似性。海洋微藻的正常生长需要适宜的光照强度范围，过高会破坏微藻藻细胞内的酶活性，导致藻细胞生长减缓和死亡，低光照条件对微藻藻细胞的生长也有不利影响，同种藻不同地理分布的藻株，其最适光照强度也可能存在差异，推测上述这些现象的产生与各种海洋微藻及其不同地理分布藻株各自所处的海区气候和水质环境有极大关联。后续研究将综合环境因素（光照、温度、盐度等）和营养盐因素，进一步明晰广西沿海防城港海区牟氏角毛藻在上述因素正交试验下的培育生长效果，以期为稳定、高效、规模化培育牟氏角毛藻提供技术指导。

4 结论

本研究对从广西沿海防城港海区分离纯化的牟氏角毛藻藻种，结合该区域气候和海水水质环境，综合藻细胞生长速度、藻细胞密度、藻细胞指数生长期稳定时长和藻体衰亡时间等指标进行研究，得出以下结论：从广西沿海区域获得的牟氏角毛藻具有耐高温和高盐的特性，其最佳的培养盐度、温度和光照强度分别为20‰、31℃和4 000 lx，且三者对牟氏角毛藻的生长均产生显著影响。