热应激对摩拉和尼里-拉菲水牛血液生化指标的影响

刘新勇，谭正准，李 辉，黄 健，罗 华，曾令湖，程隽如，钟华配，杨春艳，王晓丽，覃广胜

(1.广西大学动物科学技术学院，南宁 530005；2.中国农业科学院广西壮族自治区水牛研究所，南宁 530001)

水牛可分为河流型和沼泽型两种类型，中国的本土水牛主要是作为役用的沼泽型水牛，摩拉和尼里-拉菲水牛则是从国外引进的产奶性能优良的河流型水牛，目前在南方地区以提高生产性能为目标开展了与本地水牛的杂交改良，对新形势下南方奶业和现代牧业的发展具有重要意义。气候变化能对动物生理产生不利影响，导致生产和繁殖效率整体下降并造成巨大的经济损失，以及引起动物健康和福利等问题[1]。热应激是指当动物产生的热负荷超出其散热能力时机体所做出非特异性反应的总和。夏季热应激能引起水牛生理功能的一系列变化，包括采食量下降、激素分泌变化，呼吸频率、脉搏率、直肠温度升高及出汗、氧化应激增加等。由于水牛汗腺稀少，体表毛发稀疏，皮肤较厚且是黑色，容易吸收热量，所以当水牛暴露在炎热的环境条件下时更易受到热应激影响[2]。目前普遍认为水牛在生理上对热应激的适应性不如奶牛[3]。Lakhani等[4]和Li等[5]对不同季节摩拉和尼里-拉菲水牛生理反应和代谢相关激素以及氧化状态进行了研究，证实了热应激会对水牛生理产生不利影响。本研究旨在探讨夏季热应激和秋季非应激条件下摩拉和尼里-拉菲水牛血液生化指标的变化，通过测定能够反映机体健康状况、内分泌系统功能、抗氧化功能、正常生理代谢的生化指标，对比两种水牛热应激时体内物质代谢和某些组织器官机能状态变化及其耐热性能，为夏季水牛热应激的相关研究提供数据支持和理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验动物及饲养管理

试验在广西水牛研究所水牛种畜场进行。选择体况相近、体重275～300 kg、4～5岁、饲养管理一致的摩拉和尼里-拉菲母水牛各11 头。试验期分为热应激期(2020年7月)和非应激期(2020年11月)两个阶段，试验期和非试验期(2020年8月-2020年10月)试验牛均在同一牛栏饲养，牛栏有运动场和遮阳棚且通风良好，试验牛可以自由活动且自由采食充足的饲料和饮水。饲粮营养水平参照广西水牛研究所水牛种畜场饲养标准，饲粮主要由象草、玉米秸秆、啤酒糟、精料补充料等组成，试验期和非试验期均保持一致。

1.2 牛舍环境的温湿指数测定

采用在线扬尘监测系统(深圳市格林福泽环境科技有限公司)实时记录牛舍环境数据，将8个探头安装于牛舍墙壁，高度与动物背部接近，每1 h收集1次牛舍的温度(T，℃)和相对湿度(RH，%)数据。保证探头周围有效通风，防止阳光照射和雨淋，并避免牛触及。利用牛舍的温度和相对湿度计算牛舍环境温湿指数(THI)，THI=0.81×T+(0.99×T-14.3)×RH+46.3。以THI作为水牛热应激程度的评定标准，当THI≤72为无热应激；7288为重度热应激[6]。

1.3 血样采集及测定指标

每头试验牛采血4次，每次间隔1周。采血当天09:00(饲喂前)通过颈静脉采血10 mL，室温静置2 h,待血液凝固后3 000 r/min离心10 min，分离血清分装到EP管中，于-80 ℃保存待测。

一部分血清样品送广西国际壮医医院应用日立7020全自动生化分析仪检测，试剂盒由上海朗顿生物科技有限公司提供,测定指标包括：总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLOB)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、谷氨酰基转移酶(GGT)、总胆固醇(CHOL)、尿素氮(BUN)、甘油三酯(TG)、葡萄糖(GLU)、三碘甲腺原氨酸(T3)、四碘甲腺原氨酸(T4)、钾(K+)、钠(Na+)、氯(Cl-)和钙(Ca2+)离子含量/活性;另一部分血清样品送江苏晶美生物科技有限公司采用酶联免疫分析法(ELISA)检测，试剂盒由江苏晶美生物科技有限公司提供,测定指标包括：胰岛素样生长因子1(IGF-1)、牛皮质醇(CORT)、牛瘦素(LEP)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、总抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、热休克蛋白70(HSP70)和热休克蛋白90(HSP90)的含量/活性。

1.4 数据统计

试验数据经Excel 2016初步整理后采用SPSS 26.0软件进行单因素方差分析，以P<0.05表示差异显著。试验结果以平均值±标准差表示。

2 结 果

2.1 牛舍环境温湿指数

由表1可知，热应激期牛舍温度为31.60 ℃，相对湿度为80.13%，THI为85.25，水牛处于中度热应激；非应激期牛舍温度为21.11 ℃，相对湿度为88.18%，THI为69.10，水牛处于非应激状态。

表1 牛舍温湿指数测定结果

2.2 热应激期和非应激期的水牛部分血清生化指标比较

由表2可知，摩拉水牛热应激期的CHOL含量显著高于非应激期(P<0.05)，ALT和AST活性均显著低于非应激期(P<0.05)；尼里-拉菲水牛热应激期的ALB、CHOL、GGT含量均显著高于非应激期(P<0.05)，GLOB含量显著低于非应激期(P<0.05)。热应激期摩拉水牛的ALT活性及TP、GLOB、CHOL、BUN、TG含量均显著高于尼里-拉菲水牛(P<0.05)，ALB含量显著低于尼里-拉菲水牛(P<0.05)；非应激期摩拉水牛的ALT活性及BUN、TG、GLU含量均显著高于尼里-拉菲水牛(P<0.05)。其余生化指标在不同品种以及不同时期差异均不显著(P>0.05)。

表2 水牛部分血清生化指标测定结果

2.3 热应激期和非应激期的水牛血清激素含量比较

由表3可知，摩拉和尼里-拉菲水牛热应激期的IGF-1、CORT、LEP含量均显著低于非应激期(P<0.05)；尼里-拉菲水牛热应激期的T3、T4含量均显著高于非应激期(P<0.05)，T4含量显著高于热应激期摩拉水牛(P<0.05)；其余激素指标在不同品种以及不同时期差异均不显著(P>0.05)。

表3 水牛血清激素含量测定结果

相同指标，同行数据肩标不同大写字母表示两个时期间差异显著(P<0.05)，同列数据肩标不同小写字母表示两个品种间差异显著(P<0.05)，肩标相同字母表示差异不显著(P>0.05)。下同

For the same index，in the same row，values with different capital letter superscripts mean significant difference between two periods (P<0.05),in the same column，values with different small letter superscripts mean significant difference between two breeds (P<0.05)；While with the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05).The same as below

2.4 热应激期和非应激期的水牛血清抗氧化指标比较

由表4可知，摩拉和尼里-拉菲水牛热应激期的GSH-Px活性及T-AOC均显著低于非应激期(P<0.05)，MDA和HSP70含量均显著高于非应激期(P<0.05)；摩拉水牛热应激期的SOD活性显著高于非应激期(P<0.05)；其余抗氧化指标在不同品种以及不同时期差异均不显著(P>0.05)。

表4 水牛血清抗氧化指标测定结果

2.5 热应激期和非应激期的水牛血清离子含量比较

由表5可知，摩拉和尼里-拉菲水牛热应激期血清K+含量均显著高于非应激期(P<0.05)，Ca2+含量均显著低于非应激期(P<0.05)；摩拉水牛热应激期的Na+和Cl-含量均显著高于非应激期(P<0.05)；热应激期摩拉水牛的K+含量显著低于尼里-拉菲水牛(P<0.05)；其余离子含量在不同品种以及不同时期差异均不显著(P>0.05)。

表5 水牛血清离子含量测定结果

3 讨 论

3.1 热应激对水牛部分血清生化指标的影响

血清生化指标可以反映动物机体健康状况、适应性及生产性能，可作为量化评判个体或群体健康状况的指标[7]。血清 TP主要包括ALB和GLOB，BUN是蛋白质的代谢产物，蛋白质代谢良好时TP、ALB和BUN含量较低，而GLOB一定程度上可反映机体免疫力状况[8]。本研究中，热应激期尼里-拉菲水牛血清ALB含量显著高于其非应激期，也高于热应激期摩拉水牛，而GLOB含量则相反，但两种水牛在两个时期的TP和BUN含量均无显著差异。说明热应激对尼里-拉菲水牛的免疫水平造成了一定影响，但热应激期摩拉和尼里-拉菲水牛的蛋白质代谢状况均良好。

ALT、AST和GGT活性均可反映动物机体肝功能状况，当肝脏受损时，血清中ALT、AST和GGT浓度会升高[9]，且有研究表明GGT在反刍动物中可作为评价肝功能损伤的敏感指标[10]。CHOL可反映肝脏的类脂质代谢功能情况，在肝细胞严重受损时，血清中CHOL浓度显著下降。本研究中，除ALT活性高于默克兽医手册[11]正常范围(6.9～35.3 U/L)外，其他生化指标含量均在水牛正常范围以内，但热应激期摩拉和尼里-拉菲水牛的CHOL含量均显著高于非应激期。说明热应激虽未对摩拉和尼里-拉菲水牛的肝脏造成不良影响，但对两种水牛的类脂质代谢功能造成了一定影响。宋小珍等[9]研究发现，锦江黄牛热应激期和非热应激期的CHOL浓度不存在显著差异，与本研究结果不一致，可能是黄牛对热应激的耐受力更高，其类脂质代谢功能未受到影响。考虑到胆固醇可作为甾体激素合成的原料，未来可结合热应激对水牛生殖激素影响的研究来进一步探究CHOL能否作为水牛热应激敏感指标。

TG是血脂的主要成分，主要功能是供给与储存能量。本研究中尼里-拉菲水牛在两个时期的BUN和TG含量均显著低于摩拉水牛。由于试验牛均处于同一饲养条件，可能是摩拉和尼里-拉菲水牛对不同营养成分的吸收代谢有一定差异导致的，也可能与尼里-拉菲水牛乳脂率(6.3%)低于摩拉水牛(7.6%)有关，摩拉和尼里-拉菲水牛营养代谢方面的对比还需进一步研究。

3.2 热应激对水牛血清激素含量的影响

IGF-1是一种在肝脏中产生的内分泌激素，能促进骨骼、肌肉和内脏器官的生长[12]。CORT是肾上腺皮质合成分泌的一种类固醇激素，具有动员能源，促进脂类、蛋白质分解和糖异生作用[13]。LEP是主要由白色脂肪组织合成和分泌的蛋白质类激素，能作用于下丘脑的代谢调节中枢，发挥抑制食欲、减少能量摄取、增加能量消耗、抑制脂肪合成的作用[14]。本研究中摩拉和尼里-拉菲水牛在热应激期血清IGF-1、CORT和LEP含量均显著低于非应激期，说明热应激对水牛内分泌系统造成一定影响，机体内分泌系统通过自身调节降低了物质与能量代谢以提高机体对热应激的适应能力。研究表明，西门塔尔牛热应激期的IGF-1浓度显著下降[15]，与本研究结果一致。而廖迎新等[16]研究发现，荷斯坦奶牛热应激期的CORT浓度显著上升，可能是品种不同导致的。有关热应激水牛血液IGF-1、CORT、LEP水平的研究鲜见报道，这3个指标能否作为反映水牛热应激的敏感指标还需进一步的研究。

T3和T4能够加速脂肪和糖的代谢，从而增加机体的产热量。甲状腺激素的合成和分泌受垂体分泌的促甲状腺激素(TSH)的控制，其分泌过程与大脑皮层接受外界冷热刺激有关。研究表明，热应激可对下丘脑-垂体-甲状腺轴产生影响，使甲状腺滤泡缩小并减少T3和T4分泌，进而降低代谢率和减少产热，以增加机体对炎热环境的适应[17]。但Mayahi等[18]研究发现，水牛在夏季血清T4含量更高。而Dixit等[19]研究表明，摩拉水牛T3和T4浓度及其比率在不同季节并没有显著差异。本研究结果表明摩拉水牛T3和T4浓度在两个时期没有显著差异，而尼里-拉菲水牛热应激期的T3和T4浓度显著高于非应激期，说明热应激期摩拉和尼里-拉菲水牛均具有良好的甲状腺功能和抗热应激能力，但尼里-拉菲水牛的代谢和体温调节能力更强。

3.3 热应激对水牛血清抗氧化指标的影响

动物机体在正常情况下抗氧化能力与不断产生氧自由基的氧化能力之间保持着动态平衡，不会造成组织损伤。但当动物受到热应激影响时，自由基生成异常增多导致组织氧化损伤，并影响机体内环境的相对稳定。动物机体自身具有广泛的抗氧化防御机制，体内的抗氧化剂和抗氧化酶(如GSH-Px、SOD)都能清除脂质过氧化物及过氧化物中的醛类化合物(如MDA)，从而降低组织的损伤程度。研究表明，热应激期牛血清GSH-Px、SOD活性和T-AOC均显著低于非应激期，而血清MDA含量显著上升[5,15]，说明机体抗氧化能力减弱，抗氧化防御系统无法对抗过量的活性氧(ROS)负荷。本研究中摩拉和尼里-拉菲水牛在热应激期的GSH-Px和T-AOC活性均显著低于非应激期，MDA含量显著高于非应激期。但摩拉水牛热应激期的SOD活性显著高于非应激期，GSH-Px活性和T-AOC高于热应激期尼里-拉菲水牛。说明热应激对摩拉和尼里-拉菲水牛的抗氧化能力均造成一定影响，GSH-Px活性、T-AOC及MDA含量发生了显著的变化，但摩拉水牛比尼里-拉菲水牛具有更强的清除自由基能力。

HSP是反映动物舒适度和气候适应性的重要压力标志，是一类具有分子伴侣活性的应激信号分子，具有恢复蛋白自然结构、提高机体抗应激能力的作用[20]。研究表明，奶牛和水牛夏季血清HSP70和HSP90含量都较高[21-22]，而Manjari等[23]认为HSP70能够作为水牛热应激的生理和细胞特征标志物。本研究中，摩拉和尼里-拉菲水牛热应激期HSP70含量均显著高于非应激期，而热应激期HSP90含量与非应激期之间没有显著差异。与刘深贺[24]研究中杂交水牛夏季血浆HSP70(421.28 pg/mL)和HSP90含量(3 348.48 pg/mL)均显著高于冬季HSP70(174.11 pg/mL)和HSP90含量(947.21 pg/mL)的结果相比，本试验HSP70的结果与其相符且含量更高，而HSP90的结果与其不一致，说明水牛血清HSP70比HSP90对热应激更敏感。

3.4 热应激对水牛血清离子含量的影响

血清离子在维持机体正常生理代谢和内环境稳定方面具有重要的作用，且对应激反应中激素的合成和分泌、能量代谢、蛋白质合成、抗氧化以及免疫功能发挥都有重要作用[25]。本研究中，摩拉和尼里-拉菲水牛在热应激期血清K+含量均显著高于非应激期，摩拉水牛热应激期的Na+含量显著高于非应激期。这与廖迎新等[16]研究热应激对荷斯坦奶牛血液微量矿物元素影响的结果基本一致，其原因可能与热应激加剧新陈代谢，加强了矿物质活动有关。本研究中，摩拉水牛热应激期的Cl-含量显著高于非应激期，而摩拉和尼里-拉菲水牛热应激期的Ca2+含量均显著低于非应激期。其原因可能是热应激时水牛呼吸频率加快，血液CO2浓度下降，造成呼吸性碱中毒，机体通过尿液排出K+、Na+等碱性离子来维持正常的酸碱平衡，导致血浆渗透压降低并加强肾分泌碳酸氢盐的能力，最终使血清中Cl-含量增加以及Ca2+含量下降。这与胡煜等[26]和黄德均等[27]研究发现热应激期牛血清Ca2+含量降低、血清Cl-含量升高的结果一致。说明热应激影响了摩拉和尼里-拉菲水牛的机体电解质平衡，K+和Ca2+分别呈显著的上升与下降趋势，而尼里-拉菲水牛可能具有更强的电解质代偿能力来维持机体的内环境稳定。

4 结 论

在本试验热应激条件下，摩拉和尼里-拉菲水牛的内分泌激素水平和抗氧化能力下降，机体电解质平衡也受到影响，尼里-拉菲水牛的免疫功能也有一定下降；摩拉水牛表现出更强的清除自由基能力，尼里-拉菲水牛表现出更好的代谢、体温调节能力以及电解质代偿能力。