肺炎链球菌新型疫苗研究进展

陈春梅，颜子乙，江咏梅，崔亚利,，陈慧莲，徐 黄，苗成林，张 奕，谢 红，王 惠,王 霞△

(1.四川省眉山市妇幼保健院 a.检验科，b.院长办公室，c.医务科，四川 眉山 620000；2. 四川大学华西第二医院检验科，四川 成都 610041)

肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae, S.pn)是革兰氏阳性菌，有荚膜，可定植在人的鼻咽部，作为一种条件致病菌，通常情况下并不致病。当定植的环境发生变化，如机体抵抗力下降、呼吸道病毒感染或年老体弱等情况下，S.pn将透过黏膜防御体系发生侵袭性感染[1]。根据感染范围，肺炎链球菌相关性疾病(pneumococcal disease, PD)分为侵袭性肺炎链球菌相关性疾病(invasive pneumococcal disease, IPD)和非侵袭性肺炎链球菌相关性疾病(noninvasive pneumococcal disease，NIPD)。2018年公布的最新研究数据显示，全球约有50万名小于5岁的儿童感染S.pn 死亡，且发展中国家发病率和死亡率高于发达国家。S.pn 也是引起中国婴幼儿和老年人发病和死亡的重要病因，全球小于5岁儿童PD病例数中，中国位列第二，占全球总病例数的l2%[1]。基于PD 在全球范围内的高疾病负担，WHO 将其列为极高度推荐优先使用疫苗预防的疾病，建议并强调应将S.pn 疫苗优先纳入各国免疫计划[1]。本文回顾现有S.pn 疫苗研发和使用情况。

1 荚膜多糖与已上市疫苗

肺炎链球菌荚膜多糖是致病的主要毒力因子，不同荚膜血清型的S.pn 存活能力和致病力不同；根据荚膜多糖的组成差异，S.pn 可分为多种血清型，目前已明确的血清型有100种[2]。目前已上市应用的疫苗以荚膜多糖为基础，包括肺炎链球菌多糖疫苗(pneumococcal polysaccharide-based vaccine，PPVs)和肺炎链球菌多糖蛋白结合疫苗(pneumococcal conjugate vaccines，PCVs)。

PPV-23由23种不同的荚膜多糖抗原纯化制备，可对疫苗覆盖范围内S.pn 血清型提供保护作用，即血清1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F型，据统计，现有疫苗所包含的血清型覆盖了>85%的致病血清型[1]。然而，PPV-23为非T细胞依赖性抗原，在<2岁婴幼儿体内难以产生有效的保护性抗体。因此，PPV-23仅推荐65岁以上人群或2～65岁罹患慢性心血管疾病和糖尿病的人群使用[3]。

PCVs将荚膜多糖与蛋白质共价结合，荚膜多糖抗原由非T细胞依赖性抗原转变为T细胞依赖抗原，使婴幼儿在免疫后能产生良好的抗体应答，且能产生记忆应答。已上市使用的PCVs 包括PCV-7(血清4、6B、9V、14、18C、19F和23F型)、PCV-10(血清1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F型)和PCV-13(S.pn血清1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F型)，包含更多血清型的PCV15,PCV20(20vPnC)处于临床III期研究，然而PCVs 存在血清型覆盖有限、制备过程复杂、成本价格高、非疫苗血清型替换等缺点[4]。

另外，在长期推进PCVs 疫苗接种的地区，出现了“血清型置换”现象-即疫苗覆盖之外的血清型逐渐在临床致病株中占据流行的优势地位，且新流行的血清型菌株并没有丧失相关毒力特征[5]。因此，在越来越复杂的疫苗配方中添加血清型并不是控制抗生素耐药性威胁的长期解决方案，我们迫切的需要研发一种有效的、经济的、能发挥广谱保护作用的肺炎链球菌疫苗。

2 具有疫苗潜力的候选蛋白

蛋白疫苗作为S.pn 第三代疫苗，具有较好的免疫原性和高度的保守性，可诱导机体产生非血清型依赖的免疫保护作用，刺激T细胞诱发免疫记忆反应，同时激活黏膜免疫和系统免疫反应。此外，蛋白疫苗制备简便，成本低，易于规模化生产，因此，蛋白疫苗是目前S.pn 疫苗研究领域的研究热点。理想的S.pn 蛋白疫苗应具备以下特点：①高度的保守性，并具有较好的免疫原性；②在S.pn 表面表达，或是通过分泌方式表达；③影响S.pn 黏附或定植关键毒力因子[6,7]。

2.1 肺炎链球菌表面蛋白A(pneumococcal surface protein A，PspA)PspA是一种胆碱结合蛋白，存在于几乎所有S.pn 菌株的细胞表面，可抑制补体介导的肺炎链球菌清除。根据PspA 暴露在表面的N端结构域和氨基酸序列变异，可分为三个家族和六个类群；其中，98%的S.pn 临床分离株来自家族1(第1和2类群)和家族2(第3～5类群)[8]。PspA 具有多种生物学功能，包括抵抗乳铁蛋白杀伤的抗性[9]，以及在空间位点上阻断宿主对菌体表面磷酸胆碱残基的识别，抵抗C 反应蛋白和补体介导的免疫反应[10]。完整的PspA 蛋白在动物模型中具有跨菌株的交叉保护效果，可以抵抗多种血清的S.pn 定植和侵袭性感染[11,12]；然而，由于PspA 氨基酸序列中包含与人类心脏肌球蛋白同源的序列，人们担心使用完整的PspA 蛋白将诱发针对宿主心肌细胞的自身免疫反应；因此，开发基于PspA 疫苗的新策略将集中在PspA 中不包含与肌球蛋白任何同源性的序列区域[13]。

PspA 的N端有一个α螺旋结构，分为A、B、C3个区域，B区域表现出血清学差异，被称为进化支区域，共分为5型。Akbari 等人构建了一种基于PspA 的重组蛋白疫苗(PspAB1-5)，将所有5种B区域氨基酸序列融合到一起，并证实了该疫苗将能够针对多种血清型S.pn 提供显著的保护[14]。该型疫苗的初步成功，表明融合关键蛋白抗原表位的重组融合蛋白方案，可以克服多糖靶位疫苗的局限，为S.pn 蛋白疫苗的研发提供了新的可能。

2.2 胆碱结合蛋白A(choline binding protein A，CbpA/PspC)CbpA/PspC是一种细胞壁相关的表面蛋白，存在于几乎所有S.pn 菌株表面，PspC 在细菌粘附、侵袭和补体逃逸中起着重要作用，是重要的毒力因子[15]。它通过与分泌型免疫球蛋白A(sIgA)和层粘连素-整合素受体相互作用而发挥粘连素的作用[16]。PspC能够直接与补体组分C3结合，并将因子H 招募到细菌表面，导致补体激活减少。

在动物感染模型中，PspC 具有强免疫原性，抗PspC 特异性抗体能够保护小鼠抵抗S.pn 定植和侵袭性感染。尽管PspC 基因存在于几乎所有的肺炎链球菌中，但它具有高度多态性，使PspC 变异体在结合因子H 的能力上存在差异。据报道，表达与抗体特异性匹配的PspC 变异体的肺炎链球菌菌株能被有效地杀死，但抗体对不匹配的PspC变异体无效[17]。由于PspC蛋白序列的高度多样性，PspC全长蛋白可能不能作为理想的交叉保护性免疫疫苗。

2.3 肺炎链球菌溶血素(pneumolysin，Ply)Ply是一种胆固醇依赖性的胞膜成孔蛋白毒素，几乎在所有S.pn 菌株中均有表达[18]；其生物学结构定位在细胞壁，亦可通过辅助Sec 系统分泌至菌体外发挥毒性作用[19]。作为S.pn 最有力的毒力决定因子，Ply 几乎可以杀死任何宿主细胞。同时，Ply 具有高度的保守性和抗原性，PD 患者会针对Ply 产生高滴度抗体[20]。研究人员通过基因编辑和基因重组技术，对Ply 第146位的丙氨酸进行敲除后，极大减弱了Ply 的蛋白毒性；并将减毒Ply 作为融合蛋白抗原组分，证实了DanJ-ΔA146Ply 可以减轻S.pn 在小鼠肺部的定植数量，并可延长小鼠的生存时间，具有一定的蛋白疫苗潜力[21,22]。

2.4 组氨酸三联体(fragile histidine triad ,Pht)Pht蛋白家族包括四个高度保守的菌体表面暴露蛋白(PhtA、PhtB、PhtD和PhtE)，其共同特征是具有一个特征性的三组氨酸基序(HXXHXH)，在氨基酸序列中重复5～6次。Pht 氨基酸序列高度保守，对锌离子具有高亲和力，发挥黏附素作用；鼻咽部和肺部的高锌离子水平可以增加S.pn 的黏附面积和数量[23]。其中，PhtD 变异性最低，并且在几乎所有的S.pn 菌株表面表达，在不同菌株中具有大于97%的同源性，被认为是具有疫苗潜力的蛋白抗原。

在小鼠和灵长类动物模型中，PhtD 疫苗可以抵抗S.pn 菌体对鼻咽部和肺部的定植和侵袭；然而，这种保护作用具有血清型依赖性，PhtD 抗血清可以抵抗血清 3、4、6A 、6B 型菌株感染小鼠，但无法抵抗血清1、5型菌株的侵袭[24，25]。在Ⅰ期临床试验中，PhtD 重组蛋白疫苗具有足够的安全性和免疫原性，并且在加强免疫后可以显著提升特异性抗体效价[26]；同时，人类抗PhtD 特异性抗体可以在小鼠模型中针对血清3型菌株发挥被动保护作用[27]。

2.5 延长因子Tu(elongation factor,EF-Tu)EF-Tu是肺炎克雷伯菌、化脓性链球菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌等致病菌中最保守、最普遍的表达因子,具有分子伴侣活性，参与肽的生物合成、蛋白质折叠和细胞对应激的反应。Nagai 等研制了一种仅含有S.pn D39菌株中EF-Tu 全长蛋白的重组蛋白疫苗(rEF-Tu)[28]。rEF-Tu 免疫后，小鼠血清中细胞因子的浓度显著升高，包括IL-6、TNF-α、IFN-y和IL-17。此外，在小鼠模型中还观察到脾细胞中CD4+T 细胞数量的增加以及IgG 抗体亚类IgG1 和IgG2a 抗体的增加。抗rEF-Tu 血清可增强小鼠腹腔巨噬细胞对S.pn 的吞噬活性，且与S.pn 血清型无关；且rEF-Tu免疫后小鼠可抵抗血清2型和血清15A型(MDR菌株，multidrug resistance)S.pn 菌株的致死剂量攻击[28]。因此，肺炎链球菌EF-Tu 蛋白可能是一种具有疫苗潜力的蛋白抗原，并具有跨S.pn 血清型的保护作用。

3 全菌体疫苗(whole cell vaccines，WCVs)

WCVs包含菌体所有类型抗原，而不需要纯化单个组分。因此，它可以在发展中国家中作为PPVs 和PCVs 的经济替代品。研究表明，S.pn 灭活全菌体和减毒全菌体疫苗能够通过体液免疫和细胞免疫途径，提供不依赖于血清型的保护作用[29]。但是目前全菌体疫苗仍存在很多隐患，疫苗的保护效力受到灭活途径、给药途径、免疫途径等多因素的影响，仍需更多研究去探索。

Malley 等利用S.pn 菌株RX1 构建了一种灭活全菌体疫苗RX1ΔlytA ，它是由血清2型菌株衍生而来的一种不表达荚膜的突变体，并敲除了毒力基因lytA[30]。在动物免疫实验中，搭配霍乱毒素(cholera toxin,CT)作为佐剂进行鼻内黏膜接种，可以在小鼠和大鼠模型中，提供针对S.pn 血清6B 、3型的保护作用，减少S.pn 鼻咽部定植并延长生存时间[30]；搭配霍乱毒素结合亚基(Cholera toxin binds subunits,CTB)作为佐剂免疫小鼠，可显著降低S.pn 血清6B 、14、23F 型S.pn 菌株在小鼠鼻咽部和中耳部的定植数量[31]。Lu 等为减少疫苗株自溶以提升菌体产量，对ply 基因进行了修饰，并使用卡那霉素抗性基因替换整个lytA 基因，构建了RM200疫苗株(RX1EPdTΔlytA)。研究表明，RM200 降低了S.pn 血6B 型在小鼠鼻咽部的定植， 并能激活IL-17A 信号通路，具有良好的保护作用[32]。临床前研究表明，以氢氧化铝为佐剂的RM200 可诱导小鼠血清中IgG 抗体效价显著升高和IL-17信号通路效应[33]，可进展到临床试验中进行深入评估。Kim 等基于S.pn D39 菌株，敲除其pep27基因和comD基因，制备了一种无法黏附或定植肺组织、血液和脑组织的减毒全菌体疫苗D39Δpep27ΔcomD ，且该型减毒株无法恢复为野生型表型[34]。研究表明，D39Δpep27ΔcomD 免疫后小鼠的血清中，针对D39 株的IgG 抗体效价显著升高，同时，可诱发抗PspA 特异性IgG 抗体；该减毒疫苗显著延长了小鼠遭到异源S.pn 菌株攻击后的生存时间，并且能够诱导跨血清型的的肺部菌体清除。同时，D39Δpep27ΔcomD 在免疫功能正常和异常小鼠体内的生物安全性也得到验证，表明其可能作为全菌体疫苗的潜力[34]。

4 肺炎球菌纳米疫苗

通常而言，单独的蛋白作为疫苗候选因子，往往因其免疫原性不高，难以有效刺激宿主发生免疫应答反应，常常辅以佐剂并以肌肉注射的方式接种。但是，肌肉注射难以诱发在上呼吸道黏膜的sIgA 抗体生成，无法在S.pn 定植第一步提供保护作用；因此，需要利用适当的佐剂或免疫递送系统，通过鼻腔或口腔黏膜途径，促进抗原的摄取并延长抗原的效应性。

细菌样颗粒(Bacterioid particles,BLPs)是由食品级乳酸乳球菌通过简单的热酸处理制成，形状和大小与细菌相似(0.5～5 μm)，可作为免疫激动剂应用于黏膜免疫。Wang 等开发了一种基于BLP 递送系统的新型PspA 蛋白疫苗，PspA 通过与BLP 中蛋白锚点PA 相互作用而进行表面结合[35]。在小鼠模型中，可以抵抗S.pn 感染而发挥保护作用。在此基础上，Lu 等将PspA 家族1和家族2进行重组融合表达，可在小鼠模型中诱导更高水平的血清特异性IgG 抗体和黏膜特异性sIgA 抗体的表达，并能防止来自家族1和家族2的S.pn 菌株对小鼠的致死性呼吸系统攻击[36]。

壳聚糖是一种无毒、可生物降解、生物相容的天然多糖，被美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration,FDA)批准为安全的佐剂和疫苗递送系统，能够提高肽类的疫苗的免疫原性并诱导以IgG2a 为主的体液免疫反应。Xu 等使用壳聚糖递送PsaA 蛋白对小鼠进行鼻内黏膜免疫，可诱导细胞因子IFN-γ 、IL-17A 、IL-4 和特异性IgG 、sIgA 抗体效应水平的显著提升；同时，可显著延长小鼠在遭受S.pn 血清3、14型菌株致死性攻击后的生存时间[37]。Haryono 等使用壳聚糖递送PCV13 疫苗，相较于Quil-A 佐剂，可诱导IgG1、IgG2a、IgG2b和 IgG3抗体效价的显著提升[38]。

DOTAP/DC-chol 脂质体属于阳离子脂质体，在人体中具有生物相容性和可生物降解性，其大小、表面电荷和化学成分是作为疫苗递送系统时需要考虑的重要因素。Tada 等使用 DOTAP/DC-chol 脂质体搭载PspA 蛋白，向小鼠鼻内黏膜的树突状细胞递送抗原，可对小鼠之后遭受的致死性S.pn 攻击提供保护作用，延长小鼠生存时间；该研究结果表明，DOTAP/DC-chol 脂质体可能是S.pn 疫苗经鼻腔给药的潜在佐剂[39]。

5 结论及展望

一个多世纪以来，肺炎链球菌相关性疾病在全球范围内具有较高的发病率和死亡率，特别是在儿童、老年和免疫功能低下的人群中，接种S.pn 疫苗成为了防治PD 的最有效手段。当前，由于免疫原性不强、保护范围局限、诱发流行株血清型置换、制备工艺成本较高等因素，限制了已上市S.pn 疫苗 PPV-23 和PCV-13 的应用，亟需研发和生产新型S.pn 疫苗。目前科研人员正从蛋白疫苗、全菌体疫苗和新型材料结合疫苗等方面，探索新型S.pn 免疫策略，以寻找兼顾免疫原性强、非血清型依赖、广谱菌株保护、生产成本低的解决方案。相信在不久的将来，市面上将出现多种新型S.pn 疫苗，以弥补现有疫苗的劣势，从多途径抵抗PD 在全球范围内的流行。