miR-155通过调节IL-21受体参与特应性皮炎的发病机制初探

葛维维 吴黎明 陈再明 廖米荣

特应性皮炎（AD）是一种常见的慢性复发性炎症性皮肤病，通常发生在婴儿早期，AD发病归因于环境因素、宿主易感基因、免疫系统失调等多因素相互作用［1］。MicroRNA（miRNA）是一类小的非编码 RNA，参与机体众多生物学过程［2］。人T辅助细胞系Jurkat是近年来发现的CD4+T细胞亚群［3-4］，其可能参与包括AD在内的多种自身免疫性疾病发病过程［5］。既往研究揭示众多miRNA在免疫和炎性疾病中的作用，其中miR-155可通过下调细胞毒性T淋巴细胞抗原4（CTLA-4）增加T辅助细胞增殖反应，从而导致慢性哮喘发病［6］。产生白介素（IL）-21的T辅助细胞（Th21）是最近鉴定出的CD4+T辅助细胞亚群，在调节免疫系统中起重要作用，并参与包括AD在内的各种自身免疫和炎性疾病［7-8］。动物实验研究显示，缺乏miR-155的小鼠无法发展为实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE），而在胶原诱导的关节炎模型中，miR-155敲除小鼠对抗原特异性Th21细胞反应具有抗性［9］。本研究探讨miR-155是否通过调节IL-21受体参与AD的发病，为AD的治疗提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2018年1月至2020年5月台州市第二人民医院急性AD患者110例为观察组，根据Rajka定义的标准确诊，并使用SCORingAD（SCORAD）指数评估疾病的严重程度。纳入标准：①近6个月未接受过全身性糖皮质激素及免疫抑制剂治疗；②近1个月AD患者无疫苗接种；③近2周无感染。排除标准：①合并肿瘤者；②合并自身免疫性疾病；③其他皮肤病。同时选取健康体检者102例为对照组。两组一般情况比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。本项目经医院伦理委员会批准，所有受试者及家属知情同意。

表1 两组一般情况比较

1.2 方法 （1）外周血Jurkat细胞miR-155、IL-21R mRNA水平测定：通过Ficoll-Hypaque密度梯度离心从500 μL外周血中分离出Jurkat细胞，使用RNAiso Plus提取Jurkat细胞RNA，并在20 μL反应系统中使用Trans Script Green一步qRT-PCR SuperMix通过一步qRT-PCR检测基因的相对表达，qRT-PCR反应条件为：45 ℃，5 min ；94 ℃，30 s；（94℃，5 s；60℃，30 s）×40个循环，用2-△△Ct法分析靶基因表达量。（2）外周血CD44、IL-4、IL-10、TNF-α、hs-CRP、Th21测定：流式细胞仪（AttuneNxT，美国热电）检测CD44、Th21细胞占总淋巴细胞的比例（抗体购于上海玉博生物科技有限公司，批号：5632456、8546296），相应试剂盒评估参与者外周血中IL-4、IL-10、TNF-α、hs-CRP的水平（MSKBIO中国，武汉），使用Multiskan Sky酶标仪检测样品光密度值。（3）细胞复苏培养及分组：在含有10%FBS和1%青霉素/链霉素的RPMI-1640（美国Gibco）培养基中培养Jurkat细胞，根据制造商的说明，用lipofectamine 2000（美国Invitrogen）转 染Jurkat细 胞。miR-155 NC组、miR-155 mimics组、miR-155 inhibitor组培养方法：miRNA载体包括miR-155 NC载体（无miR-155表达）、miR-155过表达载体（mimics），miR-155低表达载体（miR-155 inhibitor组）（购自RiboBioCo，中国广州）。其载体序列分别为：5'-TGCGTGACTGAACTGACTGGACTGAC TG-3'；5'-TGCGTGACTGCAATGCGTGACTGC-3'。使用Lipofectamine2000试剂根据质粒进行差异转染，各组设6个平行样，培养72 h。（4）Jurkat细胞活力、凋亡测定：将细胞以1×103/孔的浓度铺在96孔板上，库尔特计数器孵育1天后对细胞数进行计数，并使用细胞计数试剂盒8（CCK-8）计算细胞增殖率，酶标仪检测490 nm吸光度评估细胞活力。通过胰蛋白酶消化收集细胞，并根据说明将其重悬于100 μLAnnexin V Binding Buffer中。将5 μL FITC Annexin V添加到细胞中，然后添加10 μL碘化丙啶（PI）。在室温下孵育15 min后添加400 μL膜联蛋白V结合缓冲液，通过FC500MCL流式细胞仪检测细胞凋亡。（5）Jurkat细胞IL-21R蛋白表达水平测定：将RIPA裂解试剂添加到细胞沉淀中，在冰上裂解15 min后，提取蛋白质上清液。通过双辛可宁酸（BCA）测定蛋白质量浓度后，在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）上电泳分离蛋白40 μg，电泳至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上（250 mA，100 min），在室温下封闭放置60 min，并与一抗（IL-21R，β-肌动蛋白稀释比例为1∶2,000、1∶1,500）在4℃下过夜。用磷酸盐缓冲盐水和Tween-20（PBST）洗涤3次后，加入HRP偶联的二抗（1∶5,000，60 min），然后用PBST洗涤3次，加入化学发光溶液可视化蛋白质条带。使用GS-900TM校准密度计定量密度，并使用ImageLab（BioRad）进行分析。

1.3 统计学分析 采用SPSS19.0统计软件。计量资料以（）表示，两组比较采用t检验，三组比较采用单因素方差分析，多重比较采用SNK-q检验，相关分析采用Pearson积差相关分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组miR-155、IL-21R mRNA及炎症指标比较 观察组miR-155、IL-21R mRNA、IL-4、hs-CRP、TNF-α、CD44、Th21、IL-21 水平高于对照组（P＜0.05）。

表2 两组miR-155、IL-21R mRNA及炎症指标比较（）

表2 两组miR-155、IL-21R mRNA及炎症指标比较（）

注：与对照组比较，*P＜0.05

指标 对照组（n=102） 观察组（n=110）miR-155mRNA 0.86±0.48 3.58±0.39*IL-21R mRNA 1.23±0.39 4.59±0.39*IL-4（pg/mL） 8.89±4.54 19.59±3.36*hs-CRP（μmol/L） 328.47±10.29 467.59±12.84*TNF-α（pg/mL） 4.59±2.48 39.85±5.48*CD44（%） 72.59±3.96 82.45±5.86*Th21（%） 2.30±0.58 3.96±0.39*IL-21（pg/mL） 5.54±2.69 16.96±3.55*

2.2 miR-155与各变量的相关性分析 miR-155与TNF-α、IL-4、IL-21、TH21、IL-21R mRNA、hs-CRP、CD44正相关（r=0.458、0.563、0.489、0.539、0.636、0.574、0.669，P=0.004、0.001、0.030、0.020、0.003、0.007、0.010）。

2.3 各组Jurkat细胞OD值、存活率和凋亡率比较 与Jurkat组比较，miR-155 NC组OD值、存活率、凋亡率差异无统计学意义（P＞0.05）；与Jurkat组比较，miR-155 mimics组OD值、存活率升高，凋亡率降低，miR-155 inhibitor组OD值、存活率降低，凋亡率升高（P＜0.05）；与miR-155 mimics组比较，miR-155 inhibitor组OD值、存活率降低，凋亡率升高（P＜0.05）。见表3、图1～2。

表3 各组Jurkat细胞OD值、存活率、凋亡率比较

图1 各组Jurkat克隆形成数目比较

图2 各组Jurkat细胞凋亡率比较

2.4 各组Jurkat细胞miR-155、IL-21R mRNA表达水平比较 与Jurkat组比较，miR-155 NC组miR-155、IL-21R mRNA和蛋白无明显变化（P＞0.05）；与Jurkat组比较，miR-155 mimics组细胞miR-155、IL-21R mRNA和蛋白升高，miR-155 inhibitor组细胞miR-155、IL-21R mRNA和蛋白降低（P＜0.05）；与miR-155 mimics组比较，miR-155 inhibitor组细胞miR-155、IL-21R mRNA和蛋白降低（P＜0.05）。见表4、图3。

表4 各组Jurkat细胞miR-155、IL-21R mRNA和蛋白表达比较（）

表4 各组Jurkat细胞miR-155、IL-21R mRNA和蛋白表达比较（）

注：与Jurkat组相比，*P＜0.05；与miR-155 mimics组比较，#P＜0.05

组别 复孔数 miR-155 mRNA IL-21R mRNA IL-21R蛋白（/GAPDH）Jurkat组 6 1.83±0.18 1.39±0.39 0.93±0.18 miR-155 NC 组 6 1.80±0.20 1.36±0.30 0.94±0.18 miR-155mimics组 6 3.92±0.20* 3.81±0.37* 1.28±0.17*miR-155inhibitor组 6 0.63±0.21*# 0.77±0.43*# 0.53±0.16*#

图3 各组Jurkat细胞IL-21R蛋白比较

3 讨论

AD是一种常见的慢性炎症性皮肤病，影响全世界约20%的儿童。该病表现出高度的病理生理异质性，导致相似的湿疹性皮肤病灶。皮肤组织中高水平表达的miR-155被鉴定为AD的组织标志物，这改善分子诊断。然而，当前诊断程序的侵入性、不便性限制其应用。因此，需要鉴定用于检测AD的新型非侵入性生物标志物。最近，据报道在无细胞血浆中检测到的miRNA可充当将患病个体与健康对照区分开的标记。由于血浆中miRNA的水平稳定，可重复在同一物种的个体中保持一致。血浆miRNA的非侵入性及其在疾病中的敏感性促使人们寻求更多的miRNA生物标志物。在血浆中已鉴定出约100种miRNA，这表明血浆miRNA包含多种疾病的信号，并可作为较多疾病的非侵入性诊断标记［10］。

MicroRNA（miRNA，miRs）是短的内源性非编码RNA，通过翻译抑制、mRNA失稳或这两种机制的组合抑制蛋白质编码基因的表达。miRNA在免疫稳态，淋巴谱系的发育和炎症反应中起重要的调节作用。miRNA的差异表达已在几种免疫和炎症疾病中得到证实。MiR-155在多种免疫细胞谱系表达［11］（包括T淋巴细胞、B淋巴细胞、肥大细胞、成纤维细胞、巨噬细胞和树突状细胞），其中一些与慢性皮肤炎症的发病机制有关。有报道miR-155可以直接靶向促进IL-21R［12］。miRNA通过与带有互补位点的靶mRNA的3'非翻译区（UTR）结合而起作用。在人类中，根据生物信息学分析，IL-21R也是miR-155的靶基因，最近使用TaqMan低密度阵列（TLDA）研究表明，miR-155在AD病变中过表达，并主要在浸润的免疫细胞中表达。本研究显示，观察组miR-155、IL-21R mRNA水平高于对照组，且miR-155与TNF-α、IL-4、IL-21、TH21、IL-21R mRNA、hs-CRP、CD44正相关（P＜0.05）。这与上述研究一致，同时也揭示miR-155、IL-21R在AD发病机制中具有重要调控作用。miR-155是AD皮肤中排名最高的miRNA之一（4.6倍上调）。研究表明，miR-155主要在浸润的皮肤免疫细胞中表达，特别是在CD4+T辅助细胞和树突状细胞中表达。Th21细胞是最近鉴定出的CD4+T辅助细胞亚群，通过产生有效的细胞因子IL-21R，在自身免疫以及炎症和过敏反应的发展中发挥关键作用［13-14］，这些报道均与本研究结果一致。

本研究结果表明，与Jurkat组比较，miR-155 mimics组OD值、存活率升高、细胞凋亡率降低，miR-155 inhibitor组OD值、存活率降低、细胞凋亡率升高；与miR-155mimics组比较，miR-155inhibitor组OD值、存活率降低、细胞凋亡率升高（P＜0.05），表明，miR-155能明显促进炎症细胞Jurkat增殖、抑制其凋亡。miR-155明显增加培养的CD4+T细胞中Th21细胞的百分比，并促进IL-21R的mRNA表达，以及无细胞上清液中IL-21R的蛋白浓度［15-16］。IL-21R是Janus激酶/信号转导子和转录激活子（JAK/STAT）信号通路的负调节剂，可调节T淋巴细胞的激活、发育和分化，并参与免疫和炎症性疾病。最近，通过表征IL-21R的模拟物，明确IL-21R对Th21细胞分化和功能的影响，IL-21R可促进IL-6诱导的STAT3活化并激活Th21细胞的发育［17-18］。本研究显示，与Jurkat组比较，miR-155 mimics组细胞miR-155、IL-21R mRNA和蛋白升高，miR-155 inhibitor组细胞miR-155、IL-21R mRNA和蛋白降低；与miR-155 mimics组比较，miR-155 inhibitor组单细胞miR-155、IL-21R mRNA和蛋白降低（P＜0.05），这与前述讨论一致。同时也表明在炎症细胞Jurkat中，miR-155可能通过促进IL-21R的表达进而参与AD的发病机制。

综上所述，AD患者miR-155、IL-21R表达水平升高，miR-155可能通过促进IL-21R的表达进而参与AD的发病。