生物被膜形成对大肠杆菌致病性的影响

旷年玲，左丽，吕兴帮，邓聪聪，宋瑞铭，张永英，2*

（1.河北工程大学生命科学与食品工程学院，河北 邯郸 056038；2.河北省禽病技术创新中心，河北 邯郸 056021）

1 生物被膜研究进展

生物被膜是一种结构复杂的微生物群落，即细菌细胞被自身产生的胞外聚合物（EPS）包围[1]。EPS主要由多糖、蛋白质、脂质和核酸（RNA和细胞外DNA）组成，共同形成高度水合的极性混合物，有助于形成维持生物被膜的三维结构[2]，并在抗菌剂和压力环境中保护细菌[3]。生物被膜细菌的生活方式是无休止的循环，生物被膜细菌形成过程可概括为以下5个主要阶段：黏附（微生物通过弱相互作用，如范德华力可逆吸附于生物或非生物表面）、定植（微生物通过鞭毛、菌毛、脂多糖、胞外多糖、胶原结合黏附蛋白等更强的亲疏水相互作用，不可逆地附着于生物或非生物表面）、发育（细胞增殖形成多层细胞，产生和分泌EPS）、成熟（在生物被膜内稳定形成三维群落，其中包含有效分配营养物质和信号分子通道）、主动扩散（微生物细胞由于内外因素的相互作用而成团分离或单个分离，散布的细胞随后在其他位置定植）。在上述动态过程中，具有特定的酶参与生物被膜的降解和重组，不仅导致基质的部分降解，还参与生物被膜的主动分散和随后的表面再定植。附着是生物被膜形成的开始，但主动扩散不是结束，而是下一轮生物被膜形成的开始。生物被膜的连续再循环赋予了微生物适应各种极端环境的能力[2]。

在自然环境中，约40%～80%的细菌以生物被膜为主要生活方式[2]。与浮游细菌相比，生物被膜菌的生长速率、代谢和基因表达谱均具有显著改变。嵌入生物被膜的细菌代谢活性降低，且其细胞外基质会形成保护屏障对抗抗菌药物和动物免疫系统，是生物被膜菌难以治疗的根本原因[4]。在乳制品、家禽、肉类和即食食品工业中，食物中毒的暴发与形成生物被膜的病原体有关[5]，其中65%～80%的细菌感染均与细菌生物被膜有关[4]。由此可见，细菌生物被膜的形成与其致病性密切相关。

2 生物被膜与致病性的相关性

生物被膜与其他定植感染不同，生物被膜是聚集在生物或非生物表面的细胞微菌落[6]。生物被膜形成的屏障可通过减少药物渗透，阻碍抗菌药物对细菌的治疗，从而导致治疗失败，同时还阻碍了免疫系统对微生物的识别[1]。更为重要的是，生物被膜的形成可作为保护机制对宿主产生深远的影响。此外，由于在生物被膜中生长的微生物细胞较为聚集，感染性因子均匀分布受到挑战，易受到宿主免疫反应或抗生素治疗的影响。

血管内皮细胞的相关感染是第一个被确定为具有生物被膜病因的临床感染，表明生物被膜的形成可促进动物炎症反应，原因是动物炎症因子有助于病原菌附着。经皮肤或口腔进入血液的细菌可在植入的心脏瓣膜或内皮表面定植，形成生物被膜，导致细菌性心内膜炎，表明细菌赘生物表面附着是微生物细胞与宿主产物相互作用的结果[6]。此外，生物被膜内的细菌生长速度缓慢，营养渗入受到抑制，增强了生物被膜抵抗抗菌剂的能力，加之细菌致病基因表达，最终导致动物患病并且增加了治疗难度[7]。

细菌的附着是生物被膜形成的首要条件，受细菌表型、基因型、基质、营养物质、离子强度、pH值和温度的影响。大肠杆菌通过黏附素、鞭毛、Ⅰ型菌毛、卷曲纤维和肠上皮细胞消失位点等特异性毒力因子附着于非生物和生物表面的能力，是启动感染和生物被膜形成过程中复杂而关键的一步[8]。由于生物被膜内的菌细胞密度较浮游状态多，且大多数受营养物质和氧气等条件的限制。生物被膜生长状态下的大肠杆菌与其对数期和稳定期的同种浮游菌相比，共有4 290种基因表达发生改变。基因编码的蛋白质涉及糖类代谢、能量代谢、酶、转运蛋白、转运/结合蛋白以及一些功能未知的蛋白质，且同种细菌在生物被膜状态下与其他生长阶段的基因表达有较大差异[7]。同时，生物被膜的产生与其毒力基因也显著相关[9]。

3 毒力基因与生物被膜

生物被膜状态下细菌毒力基因及抗性基因的表达与浮游菌存在较大差异，不同细菌在生物被膜形成与维持过程中的基因表达不同，在细菌生物被膜的不同时期基因表达也存在差异[10]。此外，毒力基因及抗性基因在生物被膜的形成过程中也发挥较大作用。研究发现，致病性大肠杆菌菌株在感染动物的不同阶段利用多种毒力因子定植和入侵宿主，如黏附素、毒素、铁获取系统和抗吞噬活性[11]。

3.1 外膜蛋白

外膜蛋白（OMPs）具有多种功能，包括维持细胞膜膜结构稳定性、主动和被动运输离子及溶质、信号转导、防御和催化。大多数OMPs暴露在细胞表面，对细菌与哺乳动物及其防御系统、噬菌体和其他细菌或微生物的接触十分重要[12]。大肠杆菌与肠杆菌科的其他成员相同，可通过改变外膜通透性进而影响其对抗生素的耐药性，而渗透率的降低通常与孔隙结构或生产中的缺陷有关[13]。

外膜蛋白A（OmpA）是大肠杆菌中主要的热变性外膜蛋白，是最具代表性的外膜蛋白之一[12]。OmpA在生物被膜形成、宿主细胞侵袭、孔隙形成和多重耐药性中起到重要作用，故大肠杆菌的OmpA对致病性具有关键作用，是大肠杆菌感染的主要毒力因子[14]。与OmpA缺失株相比，含OmpA菌株的侵袭程度相差约25～50倍[15]。OmpA可促进聚苯乙烯表面的大肠杆菌K-12的生物被膜形成[16]。Barrios等[17]研究发现，OmpA与大肠杆菌生物被膜的形成密切相关；在M9培养基中，OmpA缺失株的生物被膜减少72%了；LB培养基中，OmpA缺失株的生物被膜减少83%。也有研究表明，大肠杆菌的OmpA在生物被膜形成中过量表达[10]。OmpF和OmpC是大肠杆菌两种主要的运输通道[18]，也是与通透性有关的主要外膜孔蛋白。然而上述两种运输孔均为非特异性，允许亲水分子的扩散，包括β内酰胺类抗生素[13]。此外，ompC缺失会降低大肠杆菌对肠道细胞的黏附和入侵能力[19]。ompF的缺乏可对生物被膜中某些糖类和脂质的含量产生负面影响[20]，从而抑制生物被膜的形成。

3.2 Ⅰ型菌毛

Ⅰ型菌毛由fim基因群编码的亚单位基因FimA和辅助蛋白基因FimC、FimD以及调节基因FimB、FimE和黏附复合物基因FimF、FimG、FimH组成[21]。Ⅰ型菌毛可促进细菌黏附和生物被膜形成[22]，是大肠杆菌最初附着于非生物表面的必需条件，对大肠杆菌在非生物表面的不可逆黏附具有重要意义[23]。大肠杆菌生物被膜在物体表面的附着能力是大肠杆菌毒性相关的重要特征，病原菌的表面毒力因子包括可促进细菌黏附和生物被膜形成的不同附着因子。与生物被膜形成能力较差的菌株相比，生物被膜形成能力中等和较强的菌株表现出更高的Ⅰ型菌毛表达水平。在尿路致病性大肠杆菌中，Ⅰ型菌毛具有促进生物被膜形成的能力，并在附着泌尿生殖道引发感染的过程中产生关键作用。通过禽致病性大肠杆菌Ⅰ型菌毛基因缺失株对人肺上皮细胞及嗜中性粒细胞的附着试验，发现禽致病性大肠杆菌的Ⅰ型菌毛具有促进细胞附着与定植作用。此外，两株生物被膜形成能力不同且均有具有甘露糖敏感性血凝试验（MSHA）活性的鼠伤寒沙门菌分离株，区别在于fimH的两个氨基酸位点出现突变，位于61位的甘氨酸置换成丙氨酸，菌株可拥有形成生物被膜的能力[24]。

3.3 纤维素

纤维素是常见的生物被膜成分[25]，也是线性的胞外多糖[26]，由纤维素合成酶合成。BcsA、BcsB和BcsC基因是纤维素合成多酶复合体的保守亚基，编码在一个操纵子。BcsA和BcsB是两个催化亚基，存在于所有bcs酶中，其中BcsB可将聚合物引向外膜。BcsA-B可通过尿苷5'-二磷酸葡萄糖和c-di-GMP激活剂合成纤维素，C-di-GMP被认为是该细菌中纤维素生物合成的激活剂[27]。细菌纤维素参与生物被膜的形成，能够嵌入固着菌群[26]。与野生型菌株相比，重组BcsA+菌株产生的纤维素量无显著差异，且需要其他亚基才能发挥其催化活性。因此，BcsA和BcsB必须在同一膜中才能形成功能化合物，可能与BcsA和BcsB应附着在一个多肽上有关。

为进一步增强和加快细菌纤维素生成，需要更多的基因参与木聚糖在大肠杆菌中的评估和过表达[27]。Aly等[26]研究发现，BcsA和BcsB基因的缺失与生物被膜的减少相关。在不同环境条件下，携带BcsA菌株的生物被膜形成能力显著高于不携带BcsA的菌株。徐诺[28]和阴银燕等[29]研究发现，沙门菌BcsA缺失株的生物被膜形成能力下降。

3.4 溶血素

溶血素E（HlyE）是由大肠杆菌和其他肠道细菌合成的新型成孔毒素[30]。HlyE可影响Ca2+在上皮细胞中的信号传导，还能够诱导人和小鼠巨噬细胞的凋亡，并引起人类、兔子、绵羊和马红细胞溶血[31]。感染伤寒杆菌或副伤寒杆菌的机体内存在HlyE抗体，且HlyE可在机体巨噬细胞中表达并抑制细菌生长，导致慢性感染。目前测试的所有野生型伤寒和副伤寒菌株均具有HlyE功能性蛋白，表明HlyE可在这些细菌的发病机制中发挥作用[30]。此外，SlyA是MarR家族细菌转录调节剂的成员，能够直接调节大肠杆菌的HlyE。SlyA能够促进4种隐性纤膜样黏附素转录，且当SlyA过度表达时形成的生物被膜比未过度表达时增加了4倍[32]。

3.5 肠毒素

产生热不稳定（LT）和热稳定（ST）肠道毒素大肠杆菌是腹泻病的主要原因。细菌黏附素和肠道毒素是产肠毒素大肠杆菌致宿主腹泻的毒力决定因素[33]。高效LT递送到宿主细胞最有可能通过含有LT的囊泡发生，表达LT的菌株在定植方面也具有一定优势。LT基因的消除和伴随的毒性降低与在生殖道内定植减少有关，表明这种肠毒素在细菌附着过程中发挥作用。Dubreuil等[34]研究表明，LT可促进产肠毒素大肠杆菌的依从性，可能需要ADP-核糖基转移酶活性。葡萄糖在LT表达的最佳浓度下，可促进LT产生，增强细菌附着性。

3.6 血清抗性基因

部分编码黏附素、毒素或铁获取系统的基因在禽大肠杆菌病发病过程中具有潜在的重要作用，如毒力基因之一的ISS（增加血清存活）基因可参与疾病的发病机制。与健康禽类大肠杆菌分离株相比ISS基因在亚太经合组织禽病分离株中更为普遍，且ISS基因及其外膜蛋白产物是禽致病性大肠杆菌潜在的毒力检测目标[35]。ISS基因存在于Col V质粒上，其编码的ISS蛋白属于外膜蛋白的一部分[36]。白灏等[37]研究发现，大肠杆菌生物被膜形成能力增强可能与ISS和ompA转录水平上调有关。

3.7 毒力岛

3.7.1 LEE致病岛

肠道致病性大肠杆菌和肠出血性大肠杆菌是引起肠道黏膜损伤的两种重要致病菌，通过附着和脱落损伤（AE损伤）定植于肠道黏膜。诱导AE损伤的能力需要致病性毒力岛，即肠细胞消失位点（LEE）[38]。LEE是35 kb的基因簇，参与附着和消隐病变的形成、黏附肠上皮细胞和宿主信号转导通路的启动[8]。肠道致病性大肠杆菌的LEE毒力岛包含AE损伤及其他毒力因子相关的所有编码基因，主要编码Ⅲ型分泌系统（ESC或SEP）、分泌型蛋白质（ESP）及其分子伴侣、外膜蛋白紧密素（EAE）和紧密素易位受体（TIR）等[8,38]。3型分泌系统作为细菌和宿主细胞之间的桥梁，传递对宿主细胞施加改变的效应分子。基因组岛LEE在肠道致病性大肠杆菌菌株生物被膜的形成过程中具有重要作用。Mathlouthi等[39]研究发现，LEE失活的大肠杆菌附着于非生物表面时效率降低，表明LEE操纵子在生物膜的形成中具有至关重要的作用。

3.7.2 HPI毒力岛

高致病性岛（HPI）是35～45 kb的基因簇，是携带铁载体介导的铁摄取系统。HPI广泛分布于肠杆菌科，物种间高度保守，大肠杆菌和耶尔森菌的同源性为98%～100%。HPI不仅有助于铁的吸收，还可增强大肠杆菌的毒性，对大肠杆菌致病性的贡献十分复杂。HPI可增强大肠杆菌致病性，产生更严重的细胞病变效应，从而提高感染动物的病死率。HPI与致病性大肠杆菌感染巨噬细胞和自噬增强相关，其中包括PI3K/Akt/mTOR通路下调增强，也可影响致病性大肠杆菌感染3D4/21细胞中某些细胞因子分泌。HPI产生的耶尔森菌素可与铁离子、铜离子和锌离子结合，对病原菌在不同感染条件下的致病性十分重要。肠外致病性大肠杆菌中的HPI通过促进鞭毛运动使菌株适应周围环境。此外，HPI参与大肠杆菌的一些生物合成和代谢途径，如中心碳代谢和主要代谢组[40]。许绵[41]研究发现，与野生菌株对比，HPI缺失株生物被膜形成能力下降了50.97%，附着能力下降了23.3%。吴文文等[42]研究发现，缺失HPI基因的F4ac+猪肠毒性大肠杆菌菌株，生物被膜形成能力及对IPEC-J2细胞的附着能力均显著下降，表明HPI可能在猪肠毒性大肠杆菌附着过程中发挥一定作用。

生物被膜作为对抗抗菌剂和消毒剂的保护机制，是改善细菌生物适应性的手段。生物被膜几乎可在任何非生物表面形成，也可在有机体内部形成。部分大肠杆菌菌株可形成难以根除的生物被膜，并导致感染，上述感染源于导管、假体心脏瓣膜、心脏起搏器和替代关节，导致发病率和病死率提高[43]。生物被膜菌在小肠中定植的效率比浮游菌定植有效率高7～10倍。感染生物被膜细菌的小鼠也表现出严重的腹泻症状，表明无论何种形成表面，生物被膜生长菌均处于过度感染状态，并且毒力基因的总体转录丰度较高[44]。

4 结论

大肠杆菌中许多毒力因子对其生物被膜的形成具有显著影响，大肠杆菌形成生物被膜后，各毒力基因转录情况发生变化，而生物被膜对大肠杆菌致病性具有较大影响。虽然，关于生物被膜的认识已有一定进步，但对其引起的疾病和治疗方法的研究仍较少，需要制定有效的战略对抗致病性生物被膜。因此，应在检测大肠杆菌形成生物被膜后，了解各类型毒力基因转录情况，确定生物被膜对各类毒力基因的影响，从而为治疗大肠杆菌病和开发新药物提供参考。