A型肉毒毒素对大鼠唾液腺及22RV1荷瘤鼠瘤体摄取68Ga-PSMA-11的影响

傅文会，曾成润，张心怡，徐婷婷，赵艳红，张 伟，邓永琼，蒋晓丽，赵 岩，陈 跃*

[1.西南医科大学附属医院核医学科 核医学与分子影像四川省重点实验室 四川省院士(专家)工作站，2.皮肤科，3.医学整形美容中心，四川 泸州 646000]

1 材料与方法

1.1 实验动物 20只清洁(clean, CL)级健康雄性SD大鼠[西南医科大学实验动物中心提供，生产许可证号：SCXK(川)2018-17]，7～8周龄，体质量200～250 g；10只无特定病原体(specific pathogen free, SPF)级健康雄性BALB/C-nu裸鼠[北京华阜康生物科技公司提供，生产许可证号：SCXK(京)2019-0008]，4周龄，体质量17～19 g。本实验遵从《四川省实验动物管理办法》，并获西南医科大学伦理委员会批准。

1.2 主要试剂与仪器68Ga-PSMA-11(西南医科大学附属医院核医学科)，A型肉毒毒素(botulinum toxin type A, BTX-A)(兰州生物技术开发有限公司)，22RV1人前列腺癌细胞株(中国科学院细胞库)；Siemens Inveon型micro PET/CT和CAPINTEC CRC-25R型放射性核素活度计。

1.3 模型制备

1.3.1 SD大鼠 将20只SD大鼠随机分为实验组大鼠和对照组大鼠，每组各10只。采用6%硫化钠乙醇溶液于耳前及颈部脱毛，行颈部横切口，充分暴露双侧唾液腺。以4 ml生理盐水(normal saline, NS)复溶BTX-A(100 U)，配成2.5 U/0.1 ml BTX-A溶液。对实验组大鼠每侧唾液腺多点、均匀注射2.5 U/0.1 ml BTX-A溶液，对照组大鼠以相同方法注射0.1 ml NS。注射完毕后缝合、消毒、覆盖输液贴，并置于CL级环境中继续饲养。

1.3.2 荷瘤鼠 选择处于对数生长期的22RV1人前列腺癌细胞，制成浓度约5×106个/ml单细胞悬液。于BALB/C-nu裸鼠右腋下注射0.2 ml细胞液，待瘤体生长至长径约1.0 cm时，取10只生命状况及瘤体生长良好、瘤体大小相似的22RV1荷瘤裸鼠，随机分为实验组裸鼠和对照组裸鼠，每组各5只；于净化工作台上对其行颈部横切口，充分暴露双侧唾液腺。以10 ml NS复溶BTX-A(100 U)，配置成0.5 U/0.05 ml BTX-A溶液；对实验组裸鼠每侧唾液腺多点、均匀注射0.5 U/0.05 ml BTX-A溶液，对照组裸鼠以相同方法注射0.05 ml NS。注射完毕后缝合伤口、消毒、覆盖输液贴，并置于实验室独立通气笼盒中继续饲养。

1.468Ga-PSMA-11 micro PET/CT

1.4.1 SD大鼠 注射后1、2、3、4、5、6、7、8、12及16周，分别经尾静脉予2组大鼠注射68Ga-PSMA-11 15～20 MBq(0.4～0.5 mCi)，注射30 min后将其麻醉并仰卧位保定于宽约70 mm的扫描床上，使唾液腺处于视野中央，采集颅顶至腋窝水平PET/CT图像。参数：PET，时间窗3.438 ns，能量350～650 keV，矩阵128×128，采集10 min；CT，管电压80 kV，管电流500 μA，放大倍数1.0，扫描10 min。

1.4.2 22RV1荷瘤鼠 注射后1、2、3、4、5及6天，分别经尾静脉予2组荷瘤鼠注射68Ga-PSMA-11 3.0～3.7 MBq(0.08～0.10 mCi)，注射30 min后将其麻醉并俯卧位保定于宽约38 mm扫描床上，将瘤体置于视野中央，采集全身PET/CT图像，参数同上。

1.5 图像分析 采用2D滤波反投影法重建图像，以ASI Pro分析软件处理图像。由2位具有至少 3年工作经验的核医学科医师评价大鼠唾液腺及荷瘤鼠瘤体放射性分布情况：①以大鼠唾液腺为靶区绘制包围唾液腺的感兴趣体积(volume of interest, VOI)，以大脑为非靶区绘制5.0 mm×5.0 mm×5.0 mm VOI，分别测量其最大标准摄取值(maximum standard uptake value, SUVmax)，计算靶/非靶比值(target/non-target, T/NT)，即唾液腺SUVmax与大脑SUVmax比值；②以荷瘤鼠瘤体为靶区，绘制包围瘤体的VOI，以瘤体对侧相应部位为非靶区，绘制5.0 mm×5.0 mm×5.0 mm VOI，测量相应部位SUVmax，计算T/NT，即瘤体SUVmax与本底SUVmax比值。

基于上述文献统计与分析，笔者认为可从MOOC理念引入与图书馆MOOC实践经验介绍、MOOC环境下图书馆及图书馆员的“2+2”型角色定位、MOOC环境下的图书馆服务创新、MOOC环境下的信息素养教育、MOOC环境下的版权服务、MOOC平台技术支持与优化等6个方面，对国内图书馆与MOOC相关问题的研究内容进行梳理。

1.6 SD大鼠唾液腺病理学检查 显像完毕后处死大鼠，分离其双侧唾液腺，并迅速置于组织固定液中8 h；之后进行脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、HE染色、再次脱水及透明、封片等处理，并于光镜下观察腺小叶、小叶间导管及血管、腺泡结构变化。

1.7 统计学分析 采用SPSS 17.0统计分析软件。以±s表示符合正态分布的计量资料，采用独立t检验进行组间比较。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PET/CT显像

2.1.1 SD大鼠 PET/CT均清晰显示大鼠唾液腺，且鼻黏膜呈稍高显像剂摄取，余本底摄取均较低；实验组大鼠双侧唾液腺摄取程度先逐渐下降，后逐渐增加(图1)；对照组大鼠双侧唾液腺摄取程度未见明显变化(图1)。第1～3及16周组间唾液腺T/NT差异无统计学意义(P均>0.05)，第4～12周实验组大鼠唾液腺T/NT均显著低于对照组大鼠(P均<0.05)。见图2。

图1 SD大鼠68Ga-PSMA-11 micro PET/CT图 (L：左；R：右；箭示唾液腺)

图2 实验组大鼠与对照组大鼠SD大鼠不同时期唾液腺T/NT比较 (*：与对照组大鼠比较P<0.05)

2.1.2 22RV1荷瘤鼠 PET/CT清晰显示实验组裸鼠及对照组裸鼠荷瘤鼠瘤体，2组瘤体显像剂摄取程度均先逐渐增加，于第3～4天达到高峰，之后呈下降趋势(图3)；肾脏及膀胱均可见大量放射性浓聚。不同时间段组间T/NT差异均无统计学意义(P均>0.05，图4)。

图3 22RV1荷瘤鼠68Ga-PSMA-11 micro PET/CT图 A.实验组裸鼠； B.对照组裸鼠 (L：左；R：右；红箭示瘤体；蓝箭示肾脏；黄箭示膀胱)

图4 实验组裸鼠与对照组裸鼠22RV1荷瘤鼠不同时期肿瘤T/NT比较

2.2 病理学检查 光镜下见实验组大鼠及对照组大鼠唾液腺腺体结构清楚，小叶间导管与血管结构清晰，纤维结缔组织间隔均匀分布，腺泡细胞排列紧密、胞浆丰富、细胞核深染、无皱缩，见图5。

图5 SD大鼠唾液腺病理图(HE，×200) A.实验组大鼠左侧； B.实验组大鼠右侧； C.对照组大鼠左侧； D.对照组大鼠右侧

3 讨论

PSMA放射性配体在唾液腺呈高分布，可致PSMA-RLT疗效下降。177Lu-PSMA-617为PSMA-RLT代表性药物。动物唾液腺体积小，而177Lu-PSMA-617单光子成像分辨率低，无法清晰显示其放射性分布变化；且177Lu半衰期较长，不适用于短时间重复显像。68Ga为正电子，其半衰期短，可用于短时间内重复进行的PET/CT显像，且图像质量较高。本研究对大鼠唾液腺注射BTX-A后行68Ga-PSMA-11 micro PET/CT显像，观察其唾液腺PSMA放射性配体分布的变化，这些变化反映肉毒毒素对唾液腺摄取68Ga-PSMA-11的影响，从而间接评估肉毒毒素对唾液腺摄取177Lu-PSMA的影响。

BTX-A为抗胆碱能药物，具有暂时性化学去神经作用。ZEIDAN等[7]对小鼠唾液腺注射BTX与NS后行唾液腺外照射，并于不同时间点测定其唾液流率，结果显示BTX组唾液流率下降程度低于NS组，表明BTX具有唾液腺外照射防护作用。BAUM等[8]报道，对1例前列腺癌患者腮腺注射BTX-A后，腮腺68Ga-PSMA分布较基线下降64%，推测该方法有望成为PSMA-RLT中保护唾液腺的有效措施。本研究实验组大鼠接受BTX-A注射后双侧唾液腺摄取程度先逐渐下降后逐渐增加，且注射后4～12周实验组大鼠唾液腺T/NT均显著低于对照组大鼠，提示肉毒毒素可降低唾液腺摄取PSMA放射性配体，即68Ga-PSMA-11，且唾液腺功能随时间而逐渐恢复，其放射性分布亦逐渐增加；目前对其具体机制尚不清楚，可能与失神经支配后唾液腺萎缩导致PSMA表达下降有关[9-10]。注射BTX-A或NS后第16周，病理学结果显示，2组SD大鼠唾液腺组织结构均正常，提示上述改变为功能性，且为一过性。

2-(膦酰基甲基)戊二酸[2-(phosphonomethyl) pentanedioic acid, 2-PMPA]可与PSMA靶点竞争性结合而减少PSMA放射性配体分布。VORNOV等[11]发现2-PMPA降低唾液腺放射性摄取效果不佳，减少肿瘤放射性摄取高达50%；并在此基础上设计了JHU-2545，动物实验显示JHU-2545优先到达非恶性组织如唾液腺，且在显著减少唾液腺放射性摄取的同时并未减少肿瘤摄取，但对其有效性尚需进一步验证。本研究发现，不同时间段2组22RV1荷瘤鼠瘤体T/NT差异均无统计学意义，表明BTX-A并未影响其瘤体放射性摄取；此外，2组荷瘤鼠瘤体显像剂摄取程度均先逐渐增加，至第3～4天达到高峰，之后呈下降趋势，可能原因在于第3～4天肿瘤生长呈最活跃状态，故其放射性分布达到高峰，此后肿瘤逐渐坏死，放射性分布亦下降。

本研究的主要局限性：①未能直接观察BTX-A对SD大鼠及22RV1荷瘤鼠唾液腺摄取177Lu-PSMA的影响；②大鼠、裸鼠唾液腺体积过小，局部注射困难，开放切口造模时创伤性大；③肉毒毒素主要通过与受体蛋白特异性结合而发挥作用，故其降低唾液腺PSMA放射性配体摄取很可能存在饱和效应，而本研究未能观察不同剂量BTX-A对唾液腺放射性摄取的影响。

综上所述，BTX-A可有效减少大鼠唾液腺PSMA放射性配体聚集并避免影响荷瘤鼠瘤体特异性浓聚，提示其或有助于在PSMA-RLT过程中保护唾液腺，有待后续进一步观察。