circRNA作用于急性缺血性脑卒中的研究进展

郑继青，龙耀斌△，刘云

急性缺血性脑卒中（AIS）由颅内动脉闭塞或颅外颈动脉闭塞引起，约占脑卒中的85%［1］，可导致脑组织死亡、局灶性神经缺陷，给患者和社会带来巨大负担。目前，静脉溶栓和血管内治疗是临床上AIS常用的治疗方法，但存在治疗时间窗的限制以及神经细胞缺血再灌注损伤问题［2］。AIS最常用的诊断工具是CT和MRI，但MRI检查不适用于安装金属支架的患者，且价格昂贵［3］，CT对大脑早期缺血变化并不敏感［1］。因此需探索灵敏、可靠、实惠的早期筛查和诊断的生物标志物及有效治疗靶点。环状RNA（circRNA）是一类特殊的非编码RNA，以闭合环状结构命名，其环状二级结构由单链线性转录产物以反转录和共价键形成，在中枢神经系统中表达［4-5］。研究发现，circRNA能够作为微小RNA（miRNA）的内源性竞争RNA（ceRNA），与mRNA竞争性地结合miRNA的位点，通过促进或抑制mRNA的表达，调控AIS的生理功能［6］。实时荧光定量PCR和高通量测序发现circRNA有作为AIS生物标志物的潜力［7-8］。本文现围绕上述内容综述如下。

1 circRNA作为ceRNA调控AIS的生理和病理过程

Salmena等［9］提出ceRNA调控基因表达的假说，认为通过miRNA反应元件，ceRNA能形成一种大规模转录调控网络。circRNA作为一种ceRNA，在调控AIS的细胞凋亡、细胞自噬、血脑屏障及神经保护等生理病理过程中发挥关键作用。

1.1 circRNA作用于AIS的神经细胞凋亡AIS的发生发展与神经细胞凋亡失调有关，神经细胞凋亡是造成神经系统损伤的重要机制，在脑缺血早期，缺血中心区的细胞死亡以坏死为主，而缺血半暗带细胞仍有代谢活力，可以持续数个小时，其后续死亡则以神经细胞凋亡为主［10-11］。因此抑制神经细胞凋亡对减少AIS的梗死面积和改善其预后十分重要。

Liu等［12］发现circ_0007865作为miR-214-3p的ceRNA可调控FK506结合蛋白5（FKBP5）的表达，沉默circ_0007865可以通过调控miR-214-3p/FKBP5轴，促进氧糖剥夺（OGD）处理的脑微血管内皮细胞的增殖、迁移、血管生成和抑制细胞凋亡，可能为AIS的治疗靶点。有研究发现敲低circ-Memo1可调控miR-17-5p/非七激酶子同源物1（SOS1）信号通路，降低氧化应激和炎症反应，抑制脑微血管内皮细胞凋亡，减轻脑缺氧再复氧的脑微血管内皮细胞损伤［13］。生长分化因子11（GDF11）是转化生长因子-β（TGF-β）超家族成员，通过结合TGF-β的Ⅰ和Ⅱ受体来激活重组人SMAD家族成员3（Smad3）信号通路，进一步过表达Smad3蛋白来抑制脑缺血诱导的炎症反应，对神经元凋亡具有保护作用［14］。Chen等［15］发 现circUCK2作 为 内 源 性miR-125b-5p的ceRNA，过表达circUCK2可调控miR-125b-5p/GDF11途径，激活下游的TGF-β/Smad3信号通路，可提高小鼠海马神经元存活率，改善OGD诱导的神经元损伤。HECT结构域E3泛素蛋白连接酶1（HECTD1）在脑微血管内皮细胞［16］和小鼠海马神经细胞［17］的凋亡中发挥着重要作用。Chen等［18］发现circDLGAP4可通过充当miR-143的ceRNA来激活HECTD1的表达，过表达circDLGAP4会提高HECTD1的活性，从而调节脑缺血后脑血管内皮细胞的凋亡和细胞迁移，对脑缺血/再灌注损伤的修复起关键作用。此外，研究还发现外泌体circSHOC2作为miR-7670-3p的ceRNA，增强circSHOC2可提高去乙酰化酶1（SIRT1）的表达来调节神经元凋亡，推测circSHOC2/miR-7670-3p/SIRT1轴可能是AIS潜在治疗靶点［19］。

1.2 circRNA作用于AIS的血脑屏障（BBB）BBB是大脑和外周循环之间的重要屏障，能严格调节血液和大脑间的营养交换和信息转导，以维持对神经元回路、突触传递和神经发生精确控制的微环境［20］。AIS损伤后，BBB会被破坏，导致继发性脑水肿、毛细血管收缩和血流阻塞［21］，更为严重的是限制组织型纤溶酶原激活剂溶栓治疗［22］，造成AIS预后不良，因此保护BBB是治疗AIS的重要策略。

有研究者通过对脑缺血小鼠circRNA的高通量测序数据进行生物信息学分析发现，血小板源性生长因子（PDGF）和趋化因子通路等对非破坏性脑缺血刺激有重要作用［23］。抑制PDGF通路的PDGF受体α和PDGF-CC的表达可降低脑血管通透性以及限制炎性细胞进入大脑［24-25］，表明circRNA可能通过调控PDGF通路调节脑缺血的血管生成、免疫反应和神经血管保护来影响BBB的完整性。沉默miR-143可增强凋亡调节因子（PUMA）的活性来激活p53和核转录因子-κB通路以保护BBB的完整性［26］。在短暂性大脑中动脉闭塞（tMCAO）的小鼠模型及AIS患者血浆中发现circDLGAP4的表达水平显著下降，同时miR-143表达升高，circDLGAP4是miR-143的ceRNA，过表达circDLGAP4可通过调控miR-143显著增加HECTD的表达，从而减少神经元和BBB损伤，降低梗死面积［27］，表明circDLGAP4可以作为急性脑损伤新的生物标志物和潜在治疗靶点。

1.3 circRNA作用于AIS的自噬作用自噬是细胞中一种高度保守的分解代谢途径，其可通过溶酶体消化来降解蛋白质和恢复受损的细胞器［28］。自噬在脑缺血损伤后会被激活［29］，可保护神经元免受炎症侵袭［30］。近年来，研究发现circRNA在调控脑缺血后星形胶质细胞自噬中起关键作用［31］。

星形胶质细胞是中枢神经系统中最丰富的细胞类型，通过接触、相互作用来影响神经细胞功能，在维持中枢神经系统的内稳态中起着重要作用［32］。研究表明自噬可提高星形胶质细胞的活化，减轻脑梗死，改善神经系统评分［33］。Han等［34］发现tMCAO小鼠模型的脑缺血组织和AIS患者的血浆中circHECTD1的表达均上调，circHECTD1作为miR-142的ceRNA，敲除circHECTD1可调控miR-142来抑制TCDD诱导多聚核糖聚合酶（TIPARP）的表达，从而激活星形胶质细胞和诱导自噬，表明circHECTD1可以作为脑缺血诱导的星形胶质细胞激活的新生物标志物和治疗靶点。哺乳动物体内的SIRT1能够调节多种与自噬和增殖有关的转录因子的表达及活性［35］。研究发现在脑缺血期间，circSHOC2作 为miR-7670-3p的ceRNA，增 强circSHOC2的表达能够调控miR-7670-3p/SIRT1轴诱导自噬，从而抑制神经元细胞凋亡，改善神经元损伤，有助于AIS治疗［19］。

1.4 circRNA作用于AIS的神经保护缺血半暗带、梗死周围区域扩大和脑缺血/再灌引发的级联反应可以延迟数小时至数天，由此在使用溶栓法的基础上，尽早实施神经保护可以降低脑损伤，使AIS患者获得最大的治疗效益［36］。

在人神经母细胞瘤细胞和小鼠多巴胺能神经元中，过表达circDLGAP4能够提高miR-134-5p/环磷腺苷效应元件结合蛋白（CREB）通路中的脑源性神经营养因子、B细胞淋巴瘤2和过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1α的表达，从而发挥神经保护作用［37］。肿瘤坏死因子受体相关因子3（TRAF3）是肿瘤坏死因子受体家族成员之一，其在脑缺血再灌注损伤时表达水平显著升高，可加重神经元损伤，扩大脑梗死面积，抑制TRAF3表达对MCAO小鼠的脑组织具有神经保护作用［38］。miR-133b是多能间充质基质细胞的外泌体分泌的一种miRNA，过表达miR-133b可改善脑卒中后的神经可塑性和促进脑功能恢复［39］。在OGD诱导的小鼠海马神经元和鼠MCAO模型中发现，circHECTD1和TRAF3表达显著上调，miR-133b表达明显下调，通过敲低circHECTD1靶向调控miR-133b来抑制TRAF3的表达，从而减弱由脑缺血引起的神经元损伤，起到神经保护作用［40］。此外，在局灶性脑缺血再灌注的小鼠模型中发现，脑组织中circTLK1的水平显著增加，circTLK1作为 内源性miR-335-3p的ceRNA能够抑制miR-335-3p活性，导致TIPARP表达增加，随后加重神经元损伤，而敲除circTLK1后，能够显著降低梗死体积，减少神经元损伤，改善受损神经功能［41］，表明circTLK1的调控对AIS的神经元损伤发挥关键作用。Qiu等［42］发现circDLGAP4可作为miR-503-3p海绵，过表达circDLGAP4可提高神经元生长调节因子1的表达，从而减轻脑缺血期间的神经元损伤，为脑缺血提供一个潜在治疗靶点。

综上，敲低或过表达circRNAs可调节与miRNAs的结合位点，由此干预下游相关蛋白的表达，能够修复细胞功能，改善神经元损伤，减轻神经功能缺陷。此外，除充当ceRNA外，circRNA还具有转录调控及RNA结合蛋白的作用［43-44］，今后可在circRNA转录调控及RNA结合蛋白的功能上探讨对AIS发生发展的机制影响。

2 circRNA对AIS临床诊断及预后的意义

circRNAs的荧光定量PCR和高通量测序的快速发展对探索易于获得和快速测量的具有AIS诊断潜力的生物标志物具有重要意义。Peng等［45］发现，AIS患者外周血单核细胞中circHECTD1表达水平高于正常人，此外，受试者工作特征（ROC）曲线显示，circHECTD1表达可用于区分AIS患者与健康人，曲线 下 面 积（AUC）为0.814；在AIS患 者 中，circHECTD1的表达与NIHSS评分、CRP和炎性细胞因子呈正相关，揭示了circHECTD1作为AIS诊断和预后生物标志物的潜力。Zhu等［46］研究170例AIS患者和170例健康人外周血单核细胞和血清中的circDLGAP4和miR-143，发现与健康人相比，AIS患者外周血单核细胞和血清circDLGAP4表达下调，而circDLGAP4的表达与miR-143呈负相关，ROC曲线分析显示，circDLGAP4表达的AUC为0.816，对于评估AIS风险具有较好的价值;相关分析表明，AIS患者的circ DLGAP4表达与NIHSS评分和CRP水平呈负相关；此外，circDLGAP4水平也与血清中TNF-α、白细胞介素（IL）-6、IL-8和IL-22的表达呈负相关，表明circDLGAP4可作为诊断AIS的新生物标志物。

Zuo等［47］发 现，AIS患 者 与 健 康 人 比 较circFUNDC1、circPDS5B、circCDC14A的表达水平升高，circPDS5B在淋巴细胞和粒细胞中增加，而circCDC14A仅在粒细胞中升高，3个circRNAs联合诊断AIS的AUC为0.875，特异度为0.910，敏感度为0.715，且3个circRNAs的表达水平均与梗死体积呈正相关，表明3种circRNAs的联合可作为诊断和预测AIS的生物标志物。

3 总结与展望

circRNA作为ceRNA能够调控AIS的细胞凋亡、细胞自噬、血脑屏障及神经保护等生物学功能，且circRNA与AIS的梗死面积、炎症反应以及功能障碍程度密切相关，有望为防治该疾病的新药筛选、设计或基因治疗提供新的途径和思路。尽管目前ceRNA调控网络作用于AIS的研究较多，但仍存在问题：首先，AIS的机制较为复杂，且非编码RNA作用的靶点有多个，存在多个通路之间相互串扰问题；其次，目前关于circRNA的ceRNA网络调控均为AIS的细胞和动物的研究，缺乏临床样本研究，仍需进行临床研究，探讨circRNA介导ceRNA调控网络在AIS的诊断及预后中的应用价值。