牡丹花瓣冻干粉极细粉细胞破壁率的测定及营养成分分析

李雨欣，李 捷，谢艳华，罗欢欢，武俊生，林 奋，王四旺

(1.西北大学 生命科学与医学部,陕西 西安 710069;2.空军军医大学 中药与天然药物学教研室,陕西 西安 710032;3.陕西凤丹正元生物科技有限公司,陕西 西安 710077)

牡丹(PaeoniasuffruticosaAndr.)是毛茛科、芍药属植物,为多年生落叶灌木,别称鼠姑、富贵花,是我国的国花,“花中之王”[1-2]。其观赏价值极高[3], 千百年来深受中国人民的喜爱, 是我国传统名贵花卉之一。 现代研究表明， 牡丹花还具有较高的可食用价值[4]。 牡丹花瓣制成的鲜花饼[5], 牡丹花炮制成的花茶[6], 牡丹花酿成的花酒[7], 深受人们的青睐。 在人口日益增涨的今天, 资源利用问题, 是摆在我们面前不容忽视的问题。 破壁率是提高生物利用度, 减少资源浪费必不可少的手段。 因此, 本实验采用显微定量和目测法[8-10], 以牡丹花瓣冷冻干燥细粉及其低温破壁粉碎极细粉为受试物, 对其完整薄壁细胞进行计数, 测定破壁率; 进行牡丹花瓣冻干粉主要营养成分含量测定, 有助于牡丹花资源进一步开发利用。

1 主要材料

1.1 试样

牡丹花瓣冻干粉(DF),批号20190325,试样均由陕西凤丹正元生物科技有限公司提供。

1.2 试剂

水合氯醛、 氢氧化钠、 硫酸铜、 碳酸氢钠和甘油等(天津富宇化工)； 色谱甲醇(Fishers, 批号110301)、葡萄糖、3,5-二硝基水杨酸、碘、碘化钾(天津科密欧化学试剂公司)；标准抗坏血酸和FeSO4标准品(中国药品生物制品检定所)；铜、铁、锌、锰标准储备液(上海分析试剂有限公司)，均为分析纯。

1.3 仪器

移液枪(德国Eppendorf公司);振动微粉碎机(SYFM-8型,济南松岳机器有限责任公司)；显微镜(CX41型,奥林巴斯)；电子分析天平(BL310型,德国Sartorius公司);超声波清洗仪(SBS-200型,上海必能信超声仪器有限公司);凯式定氮仪(ATN-100型,上海洪纪仪器设备有限公司);快速水分测定仪(MB45型,美国奥豪斯);全自动脂肪测定仪(XD-SXT-210型,上海析达仪器有限公司);马弗炉(KSX1700型,北京西尼特科技有限公司);微量元素分析仪(TC-3010C型,山东济宁天成电子科技有限责任公司);高效液相色谱(LC-0AT，岛津);JADE-PAKPEP色谱柱(250×4.6 mm,5 μm);紫外可见分光光度计(Alpha-1860A型,上海谱元仪器有限公司)。

2 方法与结果

2.1 样品的制备

新鲜牡丹花瓣采摘自陕西省合阳地区,低温条件下,粉碎—冷冻干燥—粉碎—过80目筛,备用;牡丹花瓣冻干粉超细粉碎极细粉(CF)系取自DF，再使用低温超微破壁粉碎机粉碎,过300目筛,得极细粉。

2.2 CF细胞破壁率测定

2.2.1 DF细胞计数及其标准曲线的绘制 精密称取0.102 0,0.291 4,0.512 2,0.713 2,0.887 6,1.134 9 g DF,将DF分别放入25 mL的容量瓶中,加水合氯醛、超声处理10 min,使DF分散均匀,定容至刻度。将DF液精密吸出30 μL,装片应无气泡,显微镜(40×)观察。DF显微特征包括薄壁细胞、导管、腺毛、花粉粒(见图1)。它的薄壁细胞显微镜下观察方便,可作为测定破壁率的检测指标,即以DF中完整的薄壁细胞作为计数指标(1个视野为1个计数单位,每个浓度的溶液取8个计数单位的平均值),结果见表1。取DF的称样量为横坐标,每个计数中完整的薄壁细胞平均数为纵坐标,绘制标准曲线,得回归曲线方程Y=5.098 6x+1.822 4,R2=0.975 2,说明DF中的薄壁细胞在0.102 0～1.134 9 g范围内线性关系良好,可用来作为显微特征计数。

2.2.2 DF细胞的检测计数方法学考察

1) 精密度实验:精密称取0.713 2 g DF,同方法制片,对6个视野进行了观测,相对标准差(RSD)为9.80 %,表明该方法具有良好的精密度。

2) 稳定性实验:同方法制片,在显微镜下观察0、3、6、9、12 h,每个时间点取3个视野平均值,分别计算5个时间点的相对标准差(RSD)为9.35 %,表明DF混悬剂在12 h内比较稳定。

3) 重复性实验:在常温条件下放置同批DF 6份,在显微镜(40×)下观察,6份相对标准差(RSD)为7.90 %,表明该方法重复性较好。

A 薄壁细胞; B 导管; C 腺毛; D 花粉粒图1 DF显微特征(400×)Fig.1 DF microscopic characteristics (400×)

CF细胞破壁率的检测:分别取DF与CF,精密称取,同法制片,于显微镜下观察。分别观察25个视野(代表性视野如图2，3所示),按公式(1)计算DF和微粉CF的显微特征个数。牡丹花瓣粉显微特征(薄壁细胞)个数计算的相关参数(n=25),结果见表2。经计算可得CF的破壁率为100 %。

(1)

其中:X为每个盖玻片下的薄壁细胞特征数;V为牡丹花瓣粉混悬液总体积(mL);V′为盖玻片下混悬液体积(mL);W为牡丹花瓣粉称重量(mg)。再根据DF和CF的显微特征个数,按公式(2)计算细胞破壁率:

Y=(A-B)/A×100 %

(2)

其中：Y为细胞破壁率;A为DF显微特征个数;B为CF显微特征个数。

图2 DF显微计数(200×)Fig.2 DF microscopic counting(200×)

图3 CF显微计数(200×)Fig.3 CF microscopic counting(200×)

2.3 牡丹花瓣冻干粉营养成分含量测定

2.3.1 常规理化指标测定方法 蛋白质测定方法按照GB 5009.5—2016[11]第一法;水分测定方法按照GB 5009.3—2016[12]第一法;脂肪测定方法按照GB 5009.6—2016[13]第一法;总灰分测定方法按照GB 5009.4—2016[14]第一法;铅、砷、汞、镉、铬、钛、铜、锑、硒、猛、铁测定方法按照GB 5009.268—2016[15]第一法;维生素A、维生素E测定方法按照GB 5009.82—2016[16];维生素C测定方法按照GB 5009.86—2016[17]。

2.3.2 营养成分测定结果 如表3所示,蛋白质、水分、总灰分含量相对较高,脂肪含量偏低；维生素A、维生素E未检出,维生素C含量最高。维生素C具有很好的抗氧化作用、抗坏血酸活性,是人体不可或缺的一类维生素。综上,牡丹花瓣冻干粉具有一定的营养价值,可作为药食同源物质进行开发利用。

2.3.3 矿物元素测定结果 由表4可知，铅的含量超过国家规定的0.1 mg/kg,铬未检出,其他重金属元素符合国家规范。从微量元素角度看,牡丹花瓣粉富含多种人体必需元素如钛、铜、锑、硒、锰、铁,牡丹花瓣粉如果直接作为食品使用,可能影响人体的健康。

表4 矿物元素测定结果Tab.4 Determination results of mineral elements

3 讨论

本文首次对牡丹花瓣粉进行细胞破壁率的测定,以牡丹花瓣粉完整的薄壁细胞为特征计数物,用细胞计数法和目测法考察超细粉碎对牡丹花瓣细胞破壁率的影响,方法简便,结果可靠,可用于CF破壁率的检测。对于牡丹花瓣破壁的必要性还需大量的实验证明,对其化学成分的含量分析,动物实验的模型建立,未来应进一步完善。

结果表明,牡丹花瓣粉中的脂肪和灰分含量均处于较低水平,蛋白质含量相对较高；牡丹花瓣冻干粉中具有大量的维生素C,还富含人体必需元素如钛、铜、锑、硒、锰、铁,具有较高的营养价值和食用价值,但其铅超过了国家规范标准。因此,在牡丹花瓣粉的开发利用过程中,应采取工艺规范铅含量,才能开发成产品,供人体食用。牡丹花瓣作为富含微量元素的天然植物产品，它的开发仍有很多工作亟待开展。