天然植物精油对生物膜的抑制作用及在食品行业的应用进展

◎ 王凤婷，王金玲，李永胜，谢瑞龙

（内蒙古伊利实业集团股份有限公司，内蒙古 呼和浩特 010000）

在社会经济发展的进程下，交通运输、旅游业飞速发展，在人类频繁交往的过程中增加了食源性致病微生物的传播概率和范围。随着研究的深入，逐渐认识到大部分的细菌感染并不是由于游离状态的细菌导致的，形成生物膜的病原微生物才是食物中毒的“罪魁祸首”[1]。生物膜是被多糖基质所包围的一群细胞[2]，在分泌的多糖物质包裹下，细菌紧密黏附于有机或无机物质表面，避免外界因素作用从而离开附着物[3]。形成生物膜的细菌生理特性和形态与浮游菌相比存在明显差异，生物膜表面的细菌与膜内包裹的细菌也有着明显的不同[4]。浮游菌与生物膜表面细菌易于从外界获取营养，代谢迅速；生物膜内部包裹的细菌则需要通过结构中的管道运输营养、传递代谢物，代谢缓慢，因此结构内部细菌对外界刺激不敏感，导致形成的生物膜具有高耐药性。

食品生产行业常用的化学消毒剂，如含氯消毒液、季铵盐清洁剂、漂白剂等均不能有效去除设备表面已形成的生物膜，黏附于不锈钢表面的生物膜可耐受高浓度的氯[4]，并且杀菌时间也相对延长。生物膜结构可以影响热传递的效率，使用高温灭菌需要增加几个小时的处理时间才能达到预期的效果，因此常用的物理方法也不能高效去除已形成的生物膜[5]。生物膜内细菌难于被完全杀死，如果在食品加工过程中细菌生物膜由生产环境转移至食品表面进一步繁殖，不但加速了食品的腐败变质，也会增加食品安全风险[6]。常规的物理、化学杀菌方法存在着杀菌不彻底、影响食品食用安全、无法有效预防[7]等问题，因此对新型杀菌物质的探索是解决以上问题的重要举措。

目前，主要的新型杀菌物质研究主要集中于抗菌肽[8]、有机酸[9-10]、天然植物精油[11]等，其中天然植物精油因其广谱抗菌活性而被广泛关注。精油是由具有抗菌特性的植物合成分泌的低分子量化合物形成的复杂混合物，一般来说，它们的抗菌活性与精油中存在的一些次生代谢产物与细菌细胞结构的相互作用有关。精油中的代谢产物主要包括萜类、苯丙类、醛类、酯类、醇类和酮类，其生物活性随分子结构构型的差异而不同[12]。本文综述了生物膜的形成以及植物精油对生物膜的抑制作用，以及天然植物精油用于应对生物膜所造成危害的控制措施。

1 生物膜

1.1 生物膜的特点

“生物膜”一词在1978年被创造和使用，从那时起，生物膜相关微生物在基因转录方面与浮游的同种微生物有所不同就已经得到充分的证明[13]。生物膜被定义为附着于生物或非生物体表面，由其产生的胞外多糖、蛋白质、DNA、RNA 等包裹形成的具有三维结构的微生物聚合体[14]。在目前的研究中“异质镶嵌模型”和“蘑菇或郁金香模型”是两种典型的生物膜结构，前者依靠胞外多糖将菌体聚合为多个叠状体，再将叠状体进一步联结；后者在生物膜结构内部形成可传送营养及运输废物的管道[15]。

细菌可以在不同的物体表面上形成生物膜，如自然水域、土壤环境、活体组织、医疗设备、食品工业以及饮用水管道系统[6]，自然界中99%以上的细菌以生物膜形式存在[16]。在胞外聚合物（Extracellular Polymeric Substances，EPS）包裹作用以及结构内部代谢的作用下，生物膜可以保护微生物群落免受环境胁迫，这也是在自然和工业环境中生物膜的形成使细菌能够对噬菌体、化学多样性的生物杀菌剂、宿主免疫反应和抗生素产生耐药性的原因。

1.2 生物膜的形成

生物膜的形成受到细菌细胞特性、接触面特性、pH 值、营养成分等多种因素的影响[17]，形成过程一般包括4 个阶段。第一阶段为细菌的黏附及定植，细菌通过鞭毛运动或沉降的方式聚集在一起[18]，与接触表面在范德华力、疏水作用、静电力等非特异性作用下附着在固体表面[19]，这时分泌的胞外聚合物较少，细菌集团可以重新分散为浮游菌，因此此阶段的黏附是可逆的。第二阶段为生长阶段，聚集在一起的细菌数量逐渐增加，在分泌的表面蛋白[20]和胞外多糖的协助下更加紧密地附着于物体表面[21]，此阶段细菌的黏附由可逆转变为不可逆。第三阶段是生物膜的成熟阶段，附着在表面后，细菌进一步适应生物膜中的生活，增加的胞外聚合物质创造了一个具有保护性的环境，使生物膜内细菌对紫外光的抵抗力增加、基因交换率增加、生物降解能力改变以及次生代谢产物产生增加[22]。第四个阶段为生物膜内细菌的释放，固着在生物膜群落中的细菌要在新的区域定植必须有某种分散机制，生物膜碎片可能在流动中脱落或细菌通过从生物膜中释放的方式重新成为浮游菌，生物膜碎片或释放的浮游菌重新按照黏附及定植、生长、成熟、释放的方式在新的表面形成生物膜[23]。

1.3 生物膜在食品行业的危害

病原微生物对食品的污染一直是一个严重的公共卫生问题，也是造成全球巨大经济损失的一个原因。微生物生物膜含有破坏食品的成分和致病细菌，导致食品处理后的污染，降低了产品的质量和保质期，并且可能成为疾病传播的一种方式[24]。在许多病原体中，金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[25]和铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[26]易于在材料和设备上形成生物膜，生物和非生物表面生物膜的形成是一种潜在的危害，导致病原体在食品生产和食品污染条件下的持续循环。因此，致病菌形成的生物膜在食品、食品加工等领域造成了严重的污染问题，直接影响到人类的健康和生活。一些研究表明，生物膜的污染会导致乳制品变质，耐热芽孢杆菌产生的脂溶酶和蛋白水解酶，灭菌乳中存在或灭菌牛奶包装过程中污染相应细菌的生物膜均会导致产品的腐败，使无菌乳制品难以正常生产[27]。从卫生角度来看，病原微生物附着在与食物接触的表面可能导致潜在的卫生问题，它可以在恶劣的条件下长期存在[24]。在食品生产设施中，具有保护性的胞外聚合物的生物膜很难去除，因此必须有适当的方法来预防、减少、控制和根除食品和加工表面的生物膜形成。

2 植物精油中化合物

精油是由植物器官，包括根、茎、叶、种子等合成分泌的具有抗菌性能的低分子量化合物的复杂混合物[28]，具有强大的抗菌性能。它们的特点是具有强烈的气味，由芳香植物的次生代谢物形成，主要为萜类化合物、芳香族化合物、脂肪族化合物以及氮硫化合物[29]。起到抑制生物膜、抗菌作用的主要是萜类化合物、芳香族化合物和氮硫化合物。

萜类化合物是植物精油中含量最多的成分，又分为单萜、倍半萜、双萜、三萜类化合物等，主要为醇、酮、烯类[30]。萜类化合物具有抗菌、抗病毒、抗氧化等作用，常见的如柠檬醛、薄荷醇、青蒿素[31]、柠檬烯[32]等。芳香族化合物是含量第二多的精油成分，其中对生物膜的抑制作用研究以带有苯环的酚类化合物为主，如百里香酚[33]、香芹酚[34]、茶多酚[35]等。氮硫化合物在植物精油中虽含量较少，但具有较强气味，主要存在于香辛料中，对微生物有较好的杀菌、抑制作用。如对大蒜素的研究中发现，大蒜素通过与ica 基因家族作用、抑制生物膜形成所需重要蛋白的合成进而实现了对S.aureus 生物膜形成的抑制作用[36]。

3 植物精油对生物膜的抑制原理

因植物精油的天然、广谱抑菌和抗氧化特性[37]，近年来在食品中的应用受到了广泛关注。有研究表明，用氢氧化钠和精油配制的消毒溶液处理后的表面显示出较强的抗生物膜作用，可以用于减少微生物在食品加工表面的定植[38]。

3.1 抑制群体感应

生物膜的形成是一个复杂的过程，它取决于遗传和环境因素。基因调控的生物膜的形成是基于抑制群体感应（Quorum Sensing，QS），小的信号分子通过这种细胞间的通信系统在邻近的细菌之间进行交换。得到广泛认可的三种QS 分别为普遍存在于革兰氏阴性菌中以酰基高丝氨酸内酯及其衍生物（N-acyl-Homoserine Lactones，AHLs）为自体诱导分子的LuxI/LuxR 型群体感应；革兰氏阳性菌中以寡肽类分子AIP为自体诱导分子的三组分群体系统；以及革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌之间存在的种间信息交流信号分子[39]。植物在长期与环境中细菌抗争过程中进化出抑制QS 的机制，植物精油中恰好含有这些对病原微生物QS 系统产生抑制作用的群体感应抑制剂[40]，可以有效抑制基于QS 产生的生物膜的形成、破坏已形成的生物膜的QS 系统。

天然群体感应抑制剂可以通过抑制自体诱导分子的产生、降解已形成的自体诱导分子、竞争性地与自体诱导分子靶位点结合的方式发挥作用[39]。现有的研究中，植物精油在产生的群体感应抑制剂多是发挥抑制自体诱导分子产生的作用。亚抑菌浓度（sub-Minimum Inhibitory Concentration，sub-MIC）的薄荷精油可强烈干扰AHL 调节P.aeruginosa 和嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）的毒力因子和生物膜形成。对包含不同AHL 分子的各种革兰氏阴性病原体的QS系统的干扰能力评估显示，薄荷精油降低了AHL 依赖的紫色杆菌素的产生、毒力因子和生物膜的形成，表明其具有广谱抗QS 活性[41]。

3.2 影响生物膜相关基因的表达

植物精油可以通过影响与生物膜形成相关的基因的表达来达到抑制生物膜生长的作用。对于有鞭毛的细菌，生物膜形成初期的菌体聚集就是通过鞭毛的运动来实现，在肉桂提取物对阪崎肠杆菌（Cronobacter sakazakii）生物膜合成的抑制机理研究中发现，肉桂精油中含有的肉桂醛能够显著性抑制鞭毛结构和生物合成基因fliD 和flhD 的表达，同时对影响QS 的基因luxR 表达产生抑制作用[42]。山苍子精油作用于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌后，可有效降低多糖细胞间黏附素的产生，从而降低S.aureus 间的黏附作用。深入研究后发现多糖细胞间黏附素的形成需要由icaA 基因控制，使用8 mg·mL-1的山苍子精油能够使icaA 基因的表达量下降45.2%[43]。通过对山茶油处理的金黄色葡萄球菌与对照组样品进行全基因组测序发现，山茶油处理后不仅多糖细胞间黏附素生成相关基因icaA 的表达量下降，其他生物膜形成相关基因，如sarA、cidA、hlA的表达量也会下降[44]。

3.3 破坏生物膜结构

天然植物精油不仅对生物膜的形成起抑制作用，对于已经形成的生物膜也具有破坏作用。对于已形成的生物膜，因细菌之间以及外部由结构致密的胞外聚合物包裹，杀菌物质不易穿透聚合物作用于细菌，导致已经形成的生物膜很难彻底去除，内部细菌更是难于完全杀死。植物精油可以通过破坏生物膜结构使菌体暴露，从而达到杀菌效果。使用香芹酚和百里香酚处理后的阴沟肠杆菌C4（Enterobacter cloacae C4）生物膜，通过对胞外多糖的测定，发现其含量较未处理的生物膜显著下降，通过激光共聚焦显微镜对处理后的生物膜进行观察，发现结构明显松散，生物膜整体结构中出现较多空洞，内部活菌数量可见明显减少[45]。

4 植物精油抑菌作用在食品行业的应用

植物精油多作为食品防腐剂[46]，应用于水果、蔬菜、水产、乳制品和肉制品等多种类食品的保鲜[47]。利用百里香和和牛至油复配于大豆蛋白可食膜中，可有效抑制牛肉中S.aureus、大肠杆菌（Escherichia coli）和单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）的生长，并且适用于工业生产[48]。将牛至精油和迷迭香精油用于冷藏奶酪的保鲜中，可以在不影响乳酸菌发酵下有效抑制大肠杆菌的生长[49]。但研究表明，应用于食品加工时，精油的生物活性和杀菌效率往往会降低，需要的浓度可能比实验中获得的值高10 ～100 倍。这是由于食品中脂质成分、蛋白质和其他能够与精油相互作用的化合物的存在，降低了精油中有效成分对微生物作用的效果。且精油的特性，如在水相中的溶解度和疏水性，也会影响精油在食品生产中应用时的抗菌效果。

因此，为了解决植物精油活性物质与其他物质发生反应、易于挥发、疏水性等问题，在应用时会采用包裹、构建微乳体系等方式提高其稳定性。植物精油可以通过微胶囊技术进行包裹，使内部精油缓慢释放至周围环境中。BAYRAK 等[50]的研究表明，在蛋黄酱中加入罗勒精油微胶囊，可以有效地抑制E.coli和沙门氏菌（Salmonella）的生长，在保证了蛋黄酱微生物安全性的同时，也提高了产品的氧化稳定性、黏度和香气。或是通过低能乳化、高压均质、相变温度法制备植物精油微乳液，增强精油溶解性和生物利用度[51]。乙醇作为表面活性剂的薄荷精油微乳体系对苹果清汁中的E.coli有较好的抑制效果，该微乳体系可以通过破坏E.coli细胞膜通透性使其死亡[52]。

5 结语

生物膜的形成对食品工业会造成巨大的经济损失，生物膜会加速金属的腐蚀，使设备备件的更换频率增加；有些细菌还会分泌许多不同的蛋白水解酶和脂解酶，可以产生令人不快的气味（酸味）和味道（苦味），对产品质量造成巨大影响。更重要的是生物膜的形成还会造成公共卫生问题，导致食物中毒、胃肠炎或系统类疾病。精油作为天然抑菌剂易于获取、毒性小，并具有良好的抗菌效果。但其作为生物膜抑制剂及清除剂在食品行业中的应用还较少，因此如何安全、高效，不破坏食品质量、风味地将天然植物精油应用于食品生产过程中是一个待深入研究的课题。