山楂中黄酮的提取工艺及其调节糖脂代谢的活性研究

于舒雁，田硕

(1.郑州黄河护理职业学院，郑州 450042；2.河南中医药大学，郑州 450046)

1 概述

山楂又称红果、山里红、酸里红、酸枣等，为药食两用的植物[1]。山楂果实为圆球形，外皮红色，表面具有斑点，在我国多地均有栽培。山楂入药在我国有着悠久的历史，《本草纲目》中记载其“酸甘味温，消食积，补脾”[2]。大量药理学研究表明，山楂具有消食健胃、行气散瘀的作用，能促进人体内消化。山楂的生物活性物质多样，主要有黄酮类和皂苷类，具有较强的抗氧化、调节血脂、抗癌和降低胆固醇等作用[3]。迄今为止，已从山楂中分离了近70种黄酮类化合物，主要有槲皮素、芹菜素、木犀草素等。

山楂中黄酮类化合物的提取方法众多[4-5]，提取方法不同及山楂提取部位不同均能影响总黄酮的提取率，见表1。

表1 山楂总黄酮的提取方法以及工艺Table 1 The extraction methods and technology of total flavonoids from hawthorn

由表1可知，山楂果中总黄酮的提取率相对于干果，山楂鲜果更易提取出黄酮化合物。

现代药理研究表明黄酮物质可通过多种机制调节糖代谢和脂质代谢。谢伟华用山楂黄酮短期处理小鼠，结果表明山楂黄酮化合物能降低小鼠血清中的甘油三酯(TG)和总胆固醇(TC)，并能显著地提高高密度脂蛋白(HDL-C)水平[18]。黄欣欣以SD小鼠为实验材料，研究分析了大果山楂黄酮类物质对高脂血症小鼠相关指标的影响，结果表明大果山楂黄酮能有效降低小鼠血清和肝脏组织中TC和TG的含量[19]。

本课题组对山楂开展了黄酮化合物提取工艺和调节糖脂代谢的研究，分别以山楂果肉、山楂皮和山楂籽为研究材料，探讨山楂果不同部位所含黄酮类化合物的差异。与此同时，本文还建立了小鼠高脂血模型，以期探讨山楂黄酮化合物对小鼠糖脂代谢的影响。

2 材料与方法

2.1 材料与仪器

实验材料：山楂鲜果，购于当地农贸市场。

实验动物：清洁、健康小鼠60只，雄性，体重(25±2) g。

实验试剂：0.4 mg/mL芦丁标准液、纤维素酶(15000 U/g)、果胶酶(50 U/g)、无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠，血清TC和TG按照试剂盒的说明书进行操作。

实验仪器：分光光度计、精密电子天平、干燥箱、离心机、恒温水浴锅、血糖测定仪。

2.2 实验方法

2.2.1 山楂原料处理

选择健康、色泽鲜红、个大饱满的山楂，洗净后去皮、去籽。将山楂果肉、果皮切成小块，再将山楂籽清洗干净，分别置于80 ℃恒温干燥箱中干燥。待山楂果肉、果皮和山楂籽干燥后进行粉碎，过80目筛，备用。

2.2.2 总黄酮含量测定方法

本文选用亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠比色法测定山楂中总黄酮的含量。取7支试管，按照表2依次添加0.4 mg/mL芦丁标准液、无水乙醇、5% NaNO2溶液、10% Al(NO3)3溶液和4% NaOH溶液，充分摇匀后，用无水乙醇定容至25 mL，摇匀后室温静置15 min，并于510 nm处测定吸光度值。以芦丁浓度为横坐标，510 nm处吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，回归方程为：y=5.497x+0.022，R2=0.999。其中x为芦丁浓度(mg/mL)，y为在510 nm处测定的芦丁吸光值，其相关系数R2=0.999。

表2 芦丁标准溶液的曲线绘制Table 2 The curve drawing of rutin standard solution

2.2.3 山楂果肉、山楂皮和山楂籽中总黄酮的提取

精准称取1.00 g山楂果肉、山楂皮和山楂籽粉末，置于带冷凝管的圆底瓶中，按照料液比为1∶40 (g/mL)加入浓度为70%的乙醇40 mL，分别改变酶量和酶解时间，进行单因素实验。酶解结束后，置于300 W微波中加热90 s。

2.2.4 山楂果肉、山楂皮和山楂籽中总黄酮的测定

吸取1 mL待测样品代替芦丁标准溶液，其余操作与1.2.2一致，计算待测样品中总黄酮的提取量，公式如下：

总黄酮提取量=山楂提取液中的总黄酮含量(mg)/山楂原料(g)。

2.2.5 纤维素酶量对总黄酮提取量的影响

纤维素酶量分别为10，20，30，40，50，60 mg，70%的乙醇溶液40 mL，pH 6，60 ℃酶解2 h。反应结束后处理方法同1.2.3。

2.2.6 果胶酶量对总黄酮提取量的影响

果胶酶量分别为10，20，30，40，50，60 mg，70%的乙醇溶液40 mL，pH 6，60 ℃提取2 h。反应结束后处理方法同1.2.3。

2.2.7 酶解时间对总黄酮提取量的影响

加入40 mg纤维素酶和50 mg果胶酶，70%的乙醇溶液40 mL，pH 6，60 ℃提取20，40，60，80，100，120，140，160，180 min。反应结束后处理方法同1.2.3。

2.2.8 构建小鼠高脂血模型

选取60只健康雄性小鼠，随机均分为6个组：空白对照组、模型对照组、盐酸二甲双胍组、山楂黄酮低剂量组(1.0 g/kg)、中剂量组(2.0 g/kg)和高剂量组(3.0 g/kg)。除空白组外，其余5组均采用Bozóky等[20]研究的腹腔注射方法建立小鼠高脂血模型。将山楂黄酮粉溶于不同体积的生理盐水中，制成不同浓度、粒径约300 nm的均匀悬浊液，备用。小鼠高脂血模型建立后，每日灌胃给药1次，空白组和模型组灌胃给予等体积生理盐水，给药周期为21 d。末次给药4 h后，小鼠经摘取眼球取血，全血离心后留血清待测。

3 结果与讨论

3.1 单因素实验结果

3.1.1 纤维素酶量对总黄酮提取量的影响

图1 纤维素酶量对总黄酮提取量的影响Fig.1 Effect of cellulose amount on the extraction amount of total favonoids

由图1可知，纤维素酶量在10～40 mg之间，山楂总黄酮提取量随着纤维素酶量的增加而增大。当纤维素酶的添加量为40 mg时，山楂总黄酮提取量最大，为70.8 mg/g。然而当纤维素酶添加量超过40 mg后，山楂总黄酮提取量不但不再增加，反而呈下降趋势，原因可能是过多的纤维素酶会影响黄酮化合物的溶出。因此，山楂原料与纤维素酶的添加量比为1∶40 (g/mg)最佳。

3.1.2 果胶酶量对总黄酮提取量的影响

图2 果胶酶量对总黄酮提取量的影响Fig.2 Effect of pectinase amount on the extraction amount of total favonoids

由图2可知，果胶酶添加量在10～50 mg之间时，山楂总黄酮提取量随着果胶酶添加量的增加呈上升趋势。当果胶酶量为50 mg时，山楂总黄酮提取量达63.1 mg/g。当果胶酶量超过50 mg时，山楂黄酮提取量呈下降趋势，表明过量的果胶酶会影响黄酮类化合物的溶出。因此，山楂原料与果胶酶量的最佳比例为1∶50(g/mg)。

3.1.3 酶解时间对总黄酮提取量的影响

图3 酶解时间对总黄酮提取量的影响Fig.3 Effect of enzymolysis time on the extraction amount of total favonoids

由图3可知，当酶解时间在20～120 min之间时，山楂总黄酮的提取量随着酶解时间的延长而增大，当酶解时间为120 min时，总黄酮提取量高达109.4 mg/g。但酶解时间超过120 min后，山楂黄酮的提取量反而会下降，推测可能是因为酶解时间过长，导致胞内的杂质溶出，影响了黄酮类化合物的后续提取。因此，酶解的最佳时间为120 min。

3.2 提取山楂不同部位的总黄酮量

根据单因素实验结果，以纤维素酶添加量40 mg、果胶酶50 mg、酶解时间120 min处理山楂原料，酶解结束后，将其置于300 W微波中加热90 s，再按照2.2.4的测定方法检测黄酮的提取量。

由图4可知，与单微波法提取山楂中的总黄酮量相比，添加复合酶系(果胶酶和纤维素酶)能显著地提高总黄酮的提取量，其中山楂果肉中总黄酮量提高了58.0%，山楂皮中总黄酮含量提高了54.3%，山楂籽中总黄酮含量提高了59.8%。山楂果中，黄酮提取含量由高到低为果肉>果皮>果籽。由此表明，山楂中不同部位所含有的黄酮量也不相同，其中山楂果肉中黄酮提取总量最高，可达117.5 mg/g，而山楂籽中黄酮的提取量最低，为25.6 mg/g。

图4 两种提取方法提取山楂不同部位的总黄酮量Fig.4 The amount of total flavonoids from different parts of hawthorn by two extraction methods

3.3 山楂果肉黄酮化合物对高脂血模型小鼠血脂指标的影响

表3 各组FBG、TG、TC和HDL-C水平(x±s)Table 3 The FBG, TG, TC and HDL-C levels (x±s) in each group mmol/L

由表3可知，与空白组相比，模型组中小鼠的FBG和血清中TG、TC含量明显升高，而HDL-C含量显著降低(P<0.05)，表明小鼠的高脂血症模型建立成功。与模型组相比，经山楂黄酮高、中、低剂量处理后的小鼠，FBG和TC值均显著降低(P<0.05)；山楂黄酮高剂量组血清内TG含量显著降低，而HDL-C含量则明显上升(P<0.05)；山楂黄酮中剂量组血清内TG含量也明显降低(P<0.05)，但是HDL-C含量无显著变化；山楂黄酮低剂量组血清内TG和HDL-C含量无显著变化。与盐酸二甲双胍组相比，经山楂黄酮处理后小鼠血清中的TC含量显著增高，HDL-C含量显著减少(P<0.05)。

4 讨论

本文探索了复合酶协同微波法提取山楂中总黄酮化合物的工艺条件，采用单因素实验考察了纤维素酶、果胶酶的添加量和酶解时间对黄酮提取量的影响。研究表明最佳的纤维素酶添加量为40 mg/g，果胶酶的添加量为50 mg/g，酶解时间120 min，结合实验室前期筛选的提取条件，最终获得最佳的提取工艺为：纤维素酶40 mg/g和果胶酶50 mg/g，pH 6，酶解温度58 ℃，酶解时间为120 min，乙醇浓度为70%，液料比为40∶1 (mL/g)。在此条件下，山楂果肉中总黄酮的提取量高达117.5 mg/g，山楂皮中总黄酮的提取量为75.9 mg/g，而山楂籽中总黄酮的含量最低，为25.6 mg/g。同时，本文也探讨了山楂黄酮对小鼠糖脂代谢的影响，结果表明，山楂黄酮高、中、低剂量均可有效降低高脂血症模型小鼠的FBG、TG和TC含量(P<0.05)，还能不同程度地提高HDL-C水平(P<0.05)，由此证实山楂中黄酮类化合物有益于改善细胞的糖脂代谢过程。本文通过对山楂黄酮的提取工艺及其对糖脂代谢的影响，可为山楂黄酮类化合物在保健品的研发上提供一定的借鉴意义，同时也间接地促进了山楂多元化产品的发展。