铁皮石斛鉴定方法与技术的研究进展

陈文强，汪小福，陈笑芸，彭城，徐俊锋，蔡健*

(1.阜阳师范大学 生物与食品工程学院，安徽 阜阳 236037；2.浙江省农业科学院 农产品质量安全危害因子与风险防控国家重点实验室，浙江 杭州 310021)

铁皮石斛(DendrobiumofficinaleKimura et Migo)为兰科石斛属多年生附生型草本植物[1]，是我国常用的传统中药材，具有滋阴除热、生津养胃等功效[2]，被誉为“中华九大仙草”之首[3]。近年来，现代药理学对铁皮石斛的成分开展了深入的研究，表明其有效成分具有增加免疫力、抗衰老与氧化等作用[4]。铁皮石斛鲜枝不易保存[5]，通常会被加工成“枫斗”，铁皮枫斗是近几年来颇受欢迎的保健品之一[6]。铁皮石斛市场需求量大，但其生长规律以及野生资源的破坏使得产量不足[7]，因而价格昂贵。市场存在利用外观相似、性质相近的金钗石斛或紫皮石斛等来充当铁皮石斛原料进行加工和售卖的现象[8]，严重影响了铁皮石斛市场的健康发展，损害了消费者合法权益。

本文针对铁皮石斛的组织形态、显微鉴定、理化分析和DNA分子生物学鉴定等进行阐述，介绍这几个方面的研究进展，分析存在的问题或不足，结合新技术的涌现和实际检测的需要对铁皮石斛鉴定方法和技术的发展进行了分析和展望。

1 组织形态鉴别

组织形态鉴定主要以铁皮石斛的表面特征，包括铁皮石斛的茎、叶、花等器官以及组织学特征为研究对象。通常铁皮石斛的形态特征为：茎为丛生，呈直立状，节明显，分节处略弯曲，有些会呈“Z”状，通体圆柱；表面暗绿色或黄绿色，叶鞘具有紫色斑点；易折断，汁较为黏稠，味淡微苦而回味甜，嚼之有浓厚黏性；鲜根近乳白色，老根贴近棕色[9-14]。包英华[15]通过收集不同地区的铁皮石斛，根据种内组织形态变异特征将铁皮石斛分为9个变异类型：紫杆红叶型、红杆红叶型、青杆细茎型、青杆粗茎型、纺锤粗茎型、矮杆粗茎型、矮杆弯曲型、长杆黑节型和短杆黑节型。丁小余等[16]对不同产地的铁皮石斛进行比较，发现可分“F”枫斗型与“H”非枫斗型两类。“F”型总体更为柔软，具有较为丰富的蜡质与黏多糖，适合加工为优质枫斗；“H”型茎较长，质地坚硬，不宜作为铁皮枫斗的原料。

组织形态的鉴定是传统的铁皮石斛鉴定方法，方便快捷，主要依靠鉴定人的感官分析，基本不需要借助仪器。但对鉴定人的鉴定经验及材料的新鲜度与完整性要求较高。

2 显微鉴别

自20世纪80年代之后，随着显微技术的进一步发展，对于铁皮石斛显微性状研究越加精密。赵玉娇等[17-20]分别根据组织结构、细胞形状对铁皮石斛的茎横切面、薄壁细胞切片、维管束数量以及粉末显微特征等进行具体描述：茎切面大体呈多边形，微木化，细胞壁加厚；薄壁细胞也呈多角形，含有大量淀粉颗粒，外侧薄壁细胞中含硅质块，草酸钙针晶多成束存在，其黏液细胞多贴近表皮处；维管束略排成4～5圈，韧皮部狭小；粉末在显微镜下是淡黄色，表观呈无规则状颗粒，均能观察出淀粉颗粒，多为单粒。蔡沓栗等[14]基于《中华本草》记录，对铁皮石斛根、茎、叶进行全面的组织形态鉴定，细化仅从单一横切面分析，结合多组织细胞观察，明确其特征及鉴别方法，确定根横切面中铁皮石斛具有明显木质增厚的外皮层。蒋素华等[21]利用冷冻切片技术，通过光镜和蔗糖保护，在蔗糖质量分数8%、冷凝温度-25 ℃的最适条件，观察铁皮石斛根、茎、叶的显微结构，该方法可在兰科植物中广泛应用。同时，不同产地的铁皮石斛在显微鉴定比较时无较大区别。李娅琼等[22-23]对野生及栽培变异的铁皮石斛与普通组培铁皮石斛的显微特征进行对比，发现只有在个别部位有些不同，总体上呈现的特征是一样的。

操作简便、样品用量少是显微性状鉴定的优点，至今仍是中药材鉴定的常用方法之一。而针对铁皮石斛的显微鉴定主要偏向铁皮石斛与其余药用石斛之间的差别，缺少明确鉴定铁皮石斛的专属性状显微特征。

3 理化性质

理化鉴定指利用化学或物理的方法，对铁皮石斛中所含有效成分进行定性分析，以获取具有鉴别价值的理化特征，铁皮石斛中常用的理化鉴定方法包括色谱法、光谱法及质谱法等。

3.1 色谱法

陈晓梅等[24]利用气相色谱法(GC)分析铁皮石斛中单糖组成，多糖中甘露糖和葡萄糖相对含量比值可区分铁皮石斛与其余石斛。王丽丽等[25]采用裂解气相色谱(Py-GC)结合系统聚类分析所得的指纹图谱，能区别真伪铁皮石斛。

孟海涛[26]以铁皮石斛等3种霍山产石斛(霍山石斛、铁皮石斛与铜皮石斛)为材料，通过高效液相色谱(HPLC)技术建立霍山产3种石斛叶、茎、花的HPLC指纹图谱体系，明确铁皮石斛在(56.57±0.02)min处存在特征色谱峰。黄月纯等[27]对不同地区铁皮石斛叶片黄酮类成分标示HPLC特征图谱，表明不同产地种源成分组成和比例存在显著差异。梁芷韵等[28]优化了铁皮石斛黄酮苷类成分HPLC特征图谱分析方法，明确指出不同种源的共性成分与特异性成分，可通过参照物峰判断。宋红坤等[29]建立铁皮石斛HPLC特征图谱，初步比较8个品种石斛HPLC特征图谱差异，稳定可靠，重复性好。吴成凤[30]对铁皮石斛黄酮类成分采用超高效液相色谱技术(UHPLC)分析，且得到铁皮石斛特征图谱可将其与霍山石斛、细茎石斛成功鉴别。Xu等[31]利用高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)建立基于铁皮石斛多糖成分的HPGPC指纹图谱，成功鉴定铁皮石斛与其余石斛。

3.2 光谱法

光谱鉴定分析主要是依据植物材料中所含成分对红外光或紫外光的吸收峰值叠加后形成相应的光谱，因所含成分及含量不一，所以其所对应的出峰时间、峰形等存在差异，通过比较可实现植物间的鉴别。在铁皮石斛中常用的光谱鉴定有紫外光谱法与红外光谱法。邓星燕[32]通过紫外指纹图谱与偏最小二乘判别分析建立模法，可将云南5个地区铁皮石斛及其余9种药用石斛均成功鉴别和溯源，且发现铁皮石斛茎与叶的紫外指纹图谱差异很大，经类比后叶的紫外指纹图谱更具有产地特征。

李兆奎等[33]首次通过红外光谱法对5种常见药用石斛(包括铁皮石斛)进行鉴定分析，在1 700～1 200 cm-1与1 000～700 cm-1处均具有特征峰图，可将5种石斛成功鉴别。白音[34]对42种药用石斛进行红外光谱分析，结果表明，在3 000～2 800 cm-1以及1 800～400 cm-1范围之内，红外指纹图谱存在显著差异。上述研究说明红外光谱技术可用于多种药用石斛鉴别。刘瑞婷[35]通过近红外光谱技术结合SIMCA模式识别方法对7种不同产地的铁皮石斛进行鉴别，成功鉴别7个产地的铁皮石斛；并且针对3种不同品种枫斗完整样与粉碎样进行近红外光谱分析鉴定，均能成功鉴定。刘文杰[36]对不同产地的铁皮石斛叶、茎、根部位进行多糖红外光谱分析，得出不同产地铁皮石斛多糖含量差异很大的结论，由此可将广西、云南与浙江的铁皮石斛区分开。张雪瑛[37]利用傅里叶变换红外光谱技术得到铁皮石斛等9种石斛的特征光谱，并对4个产地的铁皮石斛进行红外光谱分析，可知在红外光谱的峰高上存在差异，可作为辅助手段建立铁皮石斛综合鉴定体系。

3.3 质谱法

杨健等[38]采用热电离质谱和稳定同位素质谱分别测定铁皮石斛中锶元素等，采用主成分分析构建(PCA)模型能够区分不同产地的铁皮石斛。严华等[39]采用微波消解法对样品进行前处理，建立电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)方法来测定铁皮石斛中5种重金属元素含量符合现行标准。潘琳琳[40]基于核磁共振(NMR)代谢组分析和最小二乘支持向量机(LS-SVM)模型鉴别铁皮石斛粉是否掺假，准确性达98%。

Jiao等[41]利用气相色谱-质谱联用(GC-MS)和液相色谱-质谱联用(LC-MS)方法，并利用PCA分析，鉴定出78种代谢物。Yang等[42]使用超高效液相色谱飞行时间质谱(UPLC-Q-TOF-MS)和多变量分析系统地表征了来自不同种源的铁皮石斛化学特征。将UPLC-Q-TOF-MS数据通过PCA分析，偏最小二乘判别分析(PLS-DA)和正交偏最小二乘分析(OPLS-DA)显示出明显的分离。马旖旎[43]针对7个不同产地的铁皮石斛采用顶空固相微萃取技术(HS-SPEM)提取铁皮石斛的有效成分，并结合GC-MS技术对相应化学成分进行解析，并建立了7个不同产地的铁皮石斛叶片有效成分的HPLC指纹图谱体系。Jin等[44]从不同生长年限的铁皮石斛和霍山石斛茎中萃取分离出代谢物，并使用气相色谱-质谱联用(GC-MS)对其进行了鉴定，对11种具有明显分化的代谢物进行主成分分析(PCA)和OPLS-DA分析，作为鉴定区分铁皮石斛和霍山石斛的生物标记。

4 DNA分子生物学鉴定

DNA分子生物学鉴定是以生物大分子核酸的多态性或特异性为基础的分子水平鉴定。DNA分子生物学鉴定具有准确性高、数量级多、遍及整个基因组、遗传稳定等优点。随着DNA分子生物学技术的发展，越来越多的DNA分子生物学技术被应用到铁皮石斛的鉴别当中。目前常用的有DNA分子标记方法(如RAPD、ISSR、AFLP等)及DNA条形码技术等。

4.1 随机扩增DNA多态性

RAPD(random amplified polymorphic DNA)技术是以PCR技术为基础，对不同模板DNA采用随机合成的寡聚核苷酸序列引物扩增，DNA片段呈现多态性[45]，仅在某一特定模板中成功扩增即可作为该模板的分子标记。Klinbunga等[46]首先通过对不同属植物进行扩增，寻找属间特有的产物，再通过对属内不同种植物进行扩增，寻找种内特有产物，最后得到种内不同个体之间的差异进行鉴别。颜松[47]利用RAPD技术对铁皮石斛基因组进行扩增，优化反应条件，为该技术在铁皮石斛的应用奠定基础。张铭等[48]通过RAPD技术对铁皮石斛基因组进行扩增，筛选最初设计的50种RAPD引物，成功选出一组对铁皮石斛具有高度特异性的引物，达到正确鉴别铁皮石斛与其余药用石斛的目的。顾慧芬等[49]对铁皮石斛试管苗采用RAPD技术，成功设计出能特异性鉴定铁皮石斛的引物，并对其进行多代培育验证其稳定性。丁鸽等[50]对8个不同地区野生铁皮石斛进行RAPD技术分析鉴别，成功设计出S412引物，该引物可将8个野生群体准确鉴别，并具有良好的稳定和重复性。

4.2 简单重复序列区间

ISSR(inter-simple sequence repeat)技术是以微卫星重复序列(SSR)为基础[51]，在其引物3′或5′端锚定2～4个碱基成为新的引物，如[CT]4CG、[AG]4CT等，通过扩增两侧反向SSR序列，电泳后呈现多态性，分析特征片段并建立进化树用于属间及种间资源鉴定等。卢家仕等[52]利用ISSR技术对24份不同石斛属样品进行多样性和聚类分析，可将24份石斛属分为6个类群，与传统分类一致。李明焱等[53]采用ISSR技术对新培育的铁皮石斛幼苗进行分析，成功筛选出铁皮石斛新品种新斛1号，电泳多态性与其余品种铁皮石斛存在明显差异。段媛媛等[54]采用单因素试验结合ISSR分子标记技术对霍山石斛与铁皮石斛进行多态性分析，筛选出6条多态性与稳定性好的引物，可用于铁皮石斛与霍山石斛的鉴定。ISSR技术汲取RAPD与SSR技术的长处，既能达到较好的稳定性，又具有操作简便、快速等优点。

4.3 扩增片段长度多态性

AFLP(amplified fragment length polymorphism)技术利用两种限制性内切酶对物种基因组DNA进行切割，该方法基于染色体上众多自然的酶切位点[55]，将碱基差异较大的物种进行快速准确鉴别。Ulrich等[56]在酶切两端接人工合成接头作为扩增模板，将人工接头碱基加上酶切位点碱基往前延伸2～3个碱基为扩增引物，再通过聚丙烯酰胺凝胶放射荧光，通过银染技术得到多态性条带。王慧中等[57]利用AFLP技术对13种石斛属植物进行遗传多样性研究，成功筛选出3对选择性扩增引物组合，将13种材料分成3类，与传统分类学结果基本一致。宋爽等[58]同样对51个药用石斛(包括35个铁皮石斛)利用AFLP技术筛选出5对特征引物，成功将铁皮石斛与其余石斛鉴别。

4.4 DNA条形码技术

目前，DNA条形码作为中药分子鉴定中的热点，自2003年加拿大圭尔夫大学Paul Hebert教授提出后，被生物界广泛关注。生命条形码联盟(CBOL)[59]对陆地907个植物样品进行研究，认为rbcL和matK片段具有很好的分辨能力，将这两个片段联合作为陆地植物的DNA条形码。王晖等[60]利用rbcL和matK对石斛属的5种石斛进行了鉴别，但是这两个基因在种内的变异率很低，不建议作为鉴别石斛属的候补DNA条形码。中国植物条形码工作组[61]对1 757个种的序列分析发现，ITS2和psbA-trnH片段具有更好的鉴定能力，将ITS2+psbA-trnH联合片段作为中药分子鉴定的通用条形码。钟志敏[62]研究将铁皮石斛与其余药用石斛进行了鉴别，发现ITS2、matK以及yclb1对于石斛属具有良好的鉴别能力。丁小余等[63]分别对枫斗类石斛ITS区全序列、nad1-intron2片段全序列、cp DNA psdA-trnH全序列进行分析鉴别，并利用位点特异性PCR对“F”型铁皮石斛与“H”型铁皮石斛ITS2序列分析，在第273位上找到SNP位点，针对该位点设计引物鉴别两种不同品质的铁皮石斛。图1为铁皮石斛DNA条形码鉴别流程。

图1 DNA条形码鉴别的流程

4.5 其他DNA分子生物学技术

刘玲等[64]利用目标区域扩增多态性TRAP(target region amplification polymorphism)技术对铁皮石斛群居及其杂交后代进行分子鉴别，通过对铁皮石斛中的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(PEPC)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)以及葡萄糖焦磷酸化酶基因(UGP)构建目标区域，呈现多态性扩增，筛选出7对引物成功将铁皮石斛野生群居鉴别，同时对杂交后代进行鉴别，能有效将亲本与后代区分，有利于选择优质品种进行人工培育。TRAP技术根据目的基因序列随机设计引物进行多态性标记，优点是极大地提高基因型与表现型一致。

此外还有简单重复序列[65](simple sequence repeat，SSR)、相关序列扩增多态性[66](sequence related amplified polymorphism，SRAP)、单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)、抑制消减杂交[67](suppression subtractive hybridization，SSH)等技术在铁皮石斛鉴定研究中的应用。

5 展望

传统的铁皮石斛鉴别方法主要依据不同石斛的特征形状或性状对石斛的质量或真伪进行评价与鉴别。然而石斛的外观极其相似，特别是相关近缘种，很难鉴别，如果是加工品如铁皮枫斗，就更加难以区分。因此，目前针对铁皮石斛的鉴定方法主要有两类，一类是理化分析方法，另一类是DNA分子生物学方法。

理化分析方法检测和分析的主体是铁皮石斛中的化学成分或元素，而铁皮石斛中的化学成分或元素多样，且受多种因素的影响，如气候环境、种质资源、栽培方式等。另一方面，目前的鉴定方法多基于单一或少数指标性成分的检测，缺乏专属性和特异性，无法对不同石斛进行精准的鉴别。随着色谱特别是质谱技术的发展，近年来基于质谱技术的代谢组学为理化分析方法提供了新的选择，代谢组学基于高通量分析技术，如核磁共振、色谱质谱和毛细管电泳质谱等技术，对铁皮石斛小分子代谢产物的组成、含量及其变化进行定性和定量分析，通过代谢物信息与其生理变化的关联分析，寻找铁皮石斛的特征代谢标志物，从而克服了目前其他理化方法检测目标单一或缺乏特异性的不足。

基于DNA分子的鉴别方法，直接从DNA分子水平反映植物物种的多样性和特异性。DNA分子受外界因素以及生物体发育阶段及器官组织差异等的影响较小，DNA分子相对稳定和便于操作，使得DNA分子鉴定技术在铁皮石斛的鉴别方面具有准确性高、重现性好等优势。然而目前无论是DNA分子标记技术还是DNA条形码技术，其检测过程仍然繁杂，而且分辨率有待提高。近年来，三代测序技术的发展，使得测序的时间及成本大大缩短与降低，因此，有望利用测序技术达到对铁皮石斛的精确鉴定。

铁皮石斛鉴定是一个跨学科交叉的研究领域。就目前的技术而言，主要为上述理化分析技术和DNA分子生物学技术。然而任何一项技术都不是万能的，每项技术都有各自的特色。为了达到鉴定的目的，技术的多元化交叉和联合是当前及未来的发展趁势。而最终的目的主要有两方面，即精确鉴定和快速鉴定。为了达到精确鉴定，一方面在现有技术的基础上升级改造和提升，另一方面是吸纳和引入新的技术，如代谢组及其他组学的发展，多组学的联合应用也为铁皮石斛的鉴定提供了新选择；三代测序技术的发展，为基于DNA序列信息的铁皮石斛精确鉴别提供了可能；再如利用数字PCR技术对铁皮石斛进行精准定量分析。在快速检测方面，以电子鼻、电子舌等各类传感器为代表的智能快检技术有望应用于铁皮石斛的快速检测与鉴定。另一方面，将新兴的芯片技术、恒温扩增技术、功能纳米材料、微流控技术及光电技术进行融合，从而打造针对铁皮石斛快速鉴定的新技术。