NICS与PGD检测胚胎染色体罗氏易位一致性的研究

胡 静，张琼芬，凡 姝

(云南大学附属医院生殖医学科，云南 昆明 650021)

染色体易位是比较常见的染色体结构异常，在正常人群中相互易位、罗氏易位发生概率分别为1/1 000～1/500和1/1 000～1/900，但是在不孕者、反复流产者中，这种概率会显著上升，达到1%～10%，其严重影响胚胎质量，不利于后代健康[1-2]。相关研究指出，染色体易位携带者是在细胞减数分裂中，染色体分离重组出现易位染色体和正常染色体高比例不平衡配子，其中罗氏易位携带者、相互易位携带者的占比分别达到66%和80%，这种占比较高的不平衡配子容易诱发反复流产、畸形胎儿、胚胎停止发育等情况，其严重影响胚胎的发育[3-4]。当然，由于染色体的相互效应，易位染色体还会影响其它相关染色体，造成新发染色体异常。为了更好地避免易位染色体对胚胎的影响，染色体易位检测成为临床重点研究的问题。临床上应用植入前遗传学诊断(preimplantation genetic diagnosis，PGD)技术检测罗氏易位携带者，而无创胚胎染色体筛查技术(non-invasive fluorescent chromosome screening technology，NICS)是近年培育试管婴儿的新型技术，2016年4月在无锡市妇幼保健院生殖中心诞生了全球首例接受NICS培育的试管婴儿[5]。为了推广NICS技术，本文回顾性地研究了罗氏易位样本，并分析NICS、PGD的一致性，以便为临床胚胎移植提供依据。

1资料与方法

1.1一般资料

选取2018年5月至2021年3月在云南大学附属医院行体外受精-胚胎移植治疗的84例不孕妇女的临床资料为研究对象，其配偶生殖功能均为正常，本研究通过伦理审查。研究对象的年龄为18～41岁，平均年龄(27.7±7.0)岁；不孕年限为1～9年，平均不孕年限(4.2±2.1)年；体质量指数(BMI)为17～27kg/m2，平均BMI(22.8±3.0)kg/m2；子宫内膜厚度为7.5～13.6mm，平均子宫内膜厚度(10.0±1.8)mm。

纳入标准：①年龄>18岁；②囊胚数>2个；③人类辅助生殖技术(assisted reproductive technology，ART)周期中获卵≥15个或者人绒毛膜促性腺激素注射当日血清雌二醇水平≥5 000pg/mL。排除标准：①同源染色体易位者；②BMI≥28kg/m2者；③并发严重心血管疾病、凝血功能疾病者；④手术禁忌者；⑤严重精神病者。

1.2检查方式

对所有研究对象都进行促性腺激素释放激素激动剂促排卵，制定和实施早卵泡期长效长促排卵方案，在月经第1～4天进行阴道B超和血促卵泡激素、孕酮、黄体生成素、雌二醇检查，注射长效达菲林(批准文号：H20110290，规格：3.75mg/支)，28～30天后进行复查，卵泡直径、子宫内膜、雌二醇等指标到达降调标准，“主导卵泡群之间≥17mm”与“≥14mm卵泡数”比值达60%～70%为扳机时机，注射艾泽(批准文号：S20110045，规格：250μg：0.5mL)扳机。扳机后36h采卵，进行体外受精。将受精卵相继进行单微滴单胚胎、囊胚养殖。为避免个案间交叉感染，每个胚胎都应用不同的巴斯德吸管，适当通过增加营养液提高游离DNA水平，之后将每个营养液转入到5μL细胞裂解缓冲液的PCR管中保存，保存温度为-20℃，培养120h，行形态学评估后，对胚囊进行激光皱缩，之后提取30μL进行NICS检测；同时，提取接受NICS检测营养液中的胚胎细胞，再接受PGD检测。采用美国Life Tech公司的ION XPRESS LIBRARY试剂盒构建测序文库，再通过纯化、洗脱等步骤收集DNA片段，而后进行测序操作。

1.3统计学方法

应用SPSS 25.0统计学软件分析数据，计数资料用例数(百分率)[n(%)]表示，采用χ2检验；采用Wilcoxon检验进行一致性分析，以P>0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1染色体异常个案情况

在84例资料中，染色体异常主要集中在8、16、22号染色体上，表现异常较为明显，其中8号染色体异常占比最高，为17.9%(15/84)；在染色体结构和数量方面，8、16、22号染色体均表现异常，在个案数量方面远高于1、2、3、4、5、6、7等其它染色体，见图1。

注：A为染色体情况;B为结构异常的染色体情况;C为数量异常的染色体情况。

2.2染色体结构及数量异常的一致性检验

NICS在检测染色体结构异常和染色体数量异常方面，阴性率与阳性率比较差异有统计学意义(P<0.05)；PGD在检测染色体结构异常和染色体数量异常方面，阴性率与阳性率比较差异也有统计学意义(P<0.05)；NICS、PGD在检测染色体结构异常和染色体数量异常方面均具有一致性(P>0.05)，见表1、表2。

表1 NICS、PGD检测染色体结构异常的一致性分析[n(%)]Table 1 Consistency of NICS with PGD in detecting chromosomal structural abnormalities [n (%)]

表2 NICS、PGD检测染色体数量异常的一致性分析[n(%)]Table 2 Consistency of NICS to PGD in detecting numerical abnormalities of the embryonic chromosomes [n (%)]

2.3罗氏易位染色体类型的一致性检验

NICS、PGD在检测正常或者易位染色体和完全新发染色体异常的阴性率与阳性率鉴别检查比较差异均有统计学意义(P<0.05)，而在相关染色体异常、相关+新发染色体异常的阴性率与阳性率鉴别检查比较差异均无统计学意义(P>0.05)；通过一致性检验，NICS、PGD在检测染色体罗氏易位类型方面具有一致性(P>0.05)，见表3。

表3 NICS、PGD检测罗氏易位染色体类型的一致性分析[n(%)]Table 3 Consistency between NICS and PGD in detecting types of chromosomal Roche translocation [n(%)]

2.4 NICS和PGD诊断受试者工作特征(ROC)曲线的分析

以个案加权NICS、PGD作为检测变量，以染色体结构异常作为状态变量，绘制ROC曲线，曲线下面积(AUC)NICS>PGD，但通过检验，Z=-1.000，P=0.317；灵敏度(χ2=2.000，P=0.157)、特异度(χ2=2.000，P=0.157)，见表4。

表4 NICS、PGD的ROC曲线分析Table 4 Analysis of ROCs of NICS and PGD

图2 NICS、PGD的ROC曲线图

3讨论

3.1 NICS和PGD检测方法分析

PGD是对体内受精配子或者胚胎移入子宫腔内进行遗传学分析，可有效去除遗传缺陷配子或者胚胎，选取正常胚胎植入子宫中的诊断方式。相关研究认为，PGD是一项有效的辅助生殖技术，可以早期预防遗传病胎儿的妊娠和出生，提高新生儿健康质量[6]。该技术对后代身心健康影响较小。国外相关研究显示，利用该技术出生的103例儿童的身高、体重、腰围、血压等生命体征差异不明显，说明了该技术的适用价值，且该技术已被广泛纳入到英国、德国、比利时、法国、以色列等合法法律规范中，被认为是规避生殖风险的一种可行方式，对治疗乳腺癌、卵巢癌等遗传性疾病具有重要意义[7-8]。但是，PGD是通过极体活检、卵裂活检、囊胚滋养外胚层细胞活检等方式实施的检测，具有一定的操作困难且影响因素多。为了解决这一问题，临床需谋求全新的辅助生殖技术。NICS是一种全新的胚胎染色体筛查技术，其利用游离在胚胎培养液中极微量基因片段，通过单细胞全基因组扩增测序技术实现对胚胎染色体的全面筛查[9-10]。该技术转变了胚胎移植的有创局面，使得胚胎样本更加安全和完整。相关研究指出，该技术适用于高龄患者、反复流产、罗氏易位携带者等，可有效地改善临床妊娠结局，提升新生儿妊娠质量[11-12]。国外研究也认为，该技术可有效地检测染色体非整数倍，为临床妊娠提供技术支撑[13-14]。

本研究显示，NICS、PGD检测染色体结构异常和染色体数量异常阴性率与阳性率比较差异均有统计学意义，表明两种方式均可有效地筛查染色体异常情况，是临床有效的筛查方法。相关研究指出，NICS是临床筛查异常染色体及规避异常妊娠、流产、胎儿畸形等方面的有效方法[15]。NICS是一项操作简便、安全可靠的胚胎植入前染色体检测方式，是将传统有创活检转变为营养液无创采集的检测方式。该技术是由亿康基因提出的，通过MALBAC技术结合第二代高通量测序方法，检测培养至囊胚期的培养液，从而比较染色体非整数倍情况。该方法节约技术成本、促进单胚胎移植、适用于高龄产妇、有助于子代健康。NICS、PGD两者在染色体结构异常和数量异常方面通过一致性检验，表明两种技术应用在胚胎染色体筛查方面效果显著，临床实践中可根据条件选取其中一种检测方式，为胚胎移植成功提供便利方法。

3.2罗氏易位染色体检测的一致性分析

本研究显示，从罗氏易位染色体类型来看，NICS、PGD在检测正常或者易位染色体和完全新发染色体异常的阴性率与阳性率鉴别检查比较差异均有统计学意义，说明这两种检测方式有助于鉴别阴性与阳性，但是在相关染色体异常、相关+新发染色体异常阴性率与阳性率鉴别检查差异并不明显，这或许与样本量较少及检测样本问题等相关，但是两者通过检验具有较高的一致性，检测胚胎染色体罗氏易位有较高的临床价值。相关研究指出，罗氏易位染色体除了13、14、15、21号外，还牵扯到其它染色体，同时罗氏易位染色体尤其集中在8、16、22号染色体异常中[16]，这与本研究结果一致。NICS、PGD的ROC曲线结果差异并不显著，表明这两种方式对罗氏易位染色体中的结构异常检测具有一定的一致性，均可应用于临床在该方面的诊断。

综上所述，NICS、PGD检测效果显著，适用于临床，同时两者在染色体结构异常、数量异常、类型检测等方面具有一致性，可根据临床实际条件选用相关技术。本文研究的创新点：一是弥补了NICS、PGD在检测罗氏易位染色体文献研究中的缺失，通过比较NICS、PGD对罗氏易位染色体检测的一致性，为临床诊断提供理论借鉴；二是肯定了NICS、PGD在检测罗氏易位染色体类型、染色体结构异常、染色体数量异常的应用价值；三是应用图表直观表达了NICS、PGD检测结果的异同。当然，本研究也存在一些不足：首先是本研选用的样本量有限，影响了研究结果的准确性，因此需要通过大样本进一步论证；其次是本研究缺乏多中心对照实验，因此尚需通过多中心、大样本、对照组实验进一步丰富及论证，以便为临床检测提供新思路。