KRTAP1-4基因多态性对陇东绒山羊羊绒性状的影响

吴新苗，罗玉柱，赵孟丽，宋宜泽，沈继源，乔莉蓉，胡丽妍，鲁玉洁，王继卿

(甘肃农业大学 动物科学技术学院/甘肃省草食动物生物技术重点实验室/甘肃省牛羊基因改良工程实验室，甘肃 兰州730070)

山羊皮肤毛囊由初级毛囊和次级毛囊构成，其中次级毛囊产生羊绒纤维。山羊绒纤维纤细，手感轻柔，光泽明亮，是昂贵的纺织材料，可用于制造各种柔美、轻薄的纺织品。山羊的产绒性能包括产绒量及羊绒纤维直径、长度、净绒率、弯曲度等，这些性状受遗传和非遗传因素的共同调控。因此，若能鉴定出调控这些性状的功能基因，则可以应用分子标记辅助选择技术对羊绒性状进行遗传改良。

角蛋白关联蛋白(keratin-associated proteins,KAPs)和角蛋白(keratins,Ks)是羊绒纤维的主要结构成分，共同决定着羊绒纤维的理化性质。根据KAPs中甘氨酸、酪氨酸和半胱氨酸含量(物质的量百分比)的差异，可将其分为3种类型：含有35%～60%甘氨酸和酪氨酸的高甘氨酸/酪氨酸KAPs、半胱氨酸含量≤30%的高硫KAPs、半胱氨酸含量>30%的超高硫KAPs[1]。目前，在哺乳动物上已鉴别出100多个KRTAPs基因，其中在山羊基因组中鉴别出了16个KRTAPs基因[2]。由于KRTAPs基因序列在物种间有一定的保守性，这表明山羊中大量的KRTAPs基因尚未被鉴定和研究。KAP1家族属于高硫KAPs家族，在羊上由KAP1-1[3-4]、KAP1-2[5-6]、KAP1-3[7-8]和KAP1-4[9-10]4个成员组成。前人已检测了绵羊和山羊KRTAP1-4基因的核苷酸序列变异[9-10]。已有研究表明，部分KRTAPs基因的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNPs)对绒山羊的羊绒性状有显著影响。例如，Zhang等[4]发现，KRTAP1-1基因的SNP(g.688T>C)可提高辽宁绒山羊的产绒量；索朗达等[11]研究表明，山羊KRTAP8-2基因上的2个SNPs(c.214A>G和c.216G>A)与西藏绒山羊的产绒量相关；Zhao等[12]在陇东绒山羊KRTAP15-1基因上发现，等位基因A可以显著降低羊绒纤维的直径。另有研究发现，KRTAP6-2[13]、KRTAP8-1[14]等基因的SNPs可显著影响山羊的绒长度和产绒量等性状。但目前尚未见KRTAP1-4基因核苷酸序列变异对动物毛绒性状影响的研究。本研究采用聚合酶链反应-单链构象多态性(polymerase chain reaction-single stranded conformation polymorphism，PCR-SSCP)、测序和逆转录聚合酶链反应(reverse transcription-PCR，RT-PCR)等技术，研究了KRTAP1-4基因在陇东绒山羊皮肤、肾脏、脾脏、肝脏、肺脏和心脏等6个组织中的表达谱，检测了该基因的核苷酸序列变异，并分析了序列变异对陇东绒山羊羊绒性状的影响，以期为陇东绒山羊羊绒性状的分子选育提供有效的遗传标记。

1 材料与方法

1.1 材 料

在甘肃省环县永峰养殖专业合作社，选择11只无亲缘关系的陇东绒山羊公羊作为父本，用人工授精技术对陇东绒山羊母羊进行配种，在后代中随机选择382只陇东绒山羊，待其生长至1岁(约4月份)时，测定产绒量和绒层高度，并采集体侧部的羊绒样本，带回实验室测量羊绒的平均纤维直径。同时，颈静脉采集试羊血样，加入酸性柠檬酸葡萄糖，放入-20 ℃冰箱保存。

另外，选择3只健康、周岁的陇东绒山羊母羊，在次级毛囊生长期屠宰后采集皮肤、肾脏、脾脏、肝脏、肺脏和心脏组织，用于构建KRTAP1-4基因的表达谱。

1.2 KRTAP1-4基因在山羊6个组织中的表达特异性

用TRIzol试剂(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)分别提取皮肤、肾脏、脾脏、肝脏、肺脏和心脏组织的总RNA，用2%琼脂糖凝胶电泳和超微量分光光度计分别检测RNA的质量和浓度。将质检合格的RNA用EvoM-MLV反转录试剂盒进行反转录得到cDNA。依据GenBank中公布的绵羊的KRTAP1-4基因序列(GenBank登录号：GQ507741.1)，针对其编码区，设计引物P1；以山羊β-肌动蛋白基因(β-actin)作为内参，设计其引物。P1和β-actin引物信息见表1。采用20 μL体系进行RT-PCR分析，包括Taq预混酶(大连)10 μL，上游和下游引物(0.25 μmol/L)各0.8 μL，cDNA(约50 ng/μL) 0.8 μL，ddH2O 7.6 μL。PCR扩增条件为：94 ℃预变性5 min； 94 ℃变性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35个循环；72 ℃延伸7 min。对扩增产物进行1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测。

表1 PCR引物信息Table 1 Information of PCR primers

1.3 KRTAP1-4基因的PCR-SSCP分析

1.3.1 PCR分析 参照GenBank中绵羊的KRTAP1-4基因序列(GenBank登录号：GQ507741.1)，设计引物P2，扩增山羊KRTAP1-4基因，具体信息见表1。采用苯酚-氯仿抽提法提取血样基因组DNA。PCR扩增山羊的KRTAP1-4基因，反应体系为20 μL：Taq预混酶(大连)10 μL，上游和下游引物(0.25 μmol/L)各0.8 μL，血液基因组DNA模板(约50 ng/μL)0.8 μL，ddH2O 7.6 μL。PCR扩增条件为：94 ℃预变性5 min； 94 ℃变性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35个循环；72 ℃延伸7 min。用1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增效果。

1.3.2 SSCP分析 取SSCP上样缓冲液9 μL，加入PCR扩增产物1 μL，105 ℃变性10 min后，立刻放入冰水混合物中，快速上样于10%、丙烯酰胺与甲叉双炳烯酰胺体积比为39∶1的非变性聚丙烯酰胺凝胶中，在180 V、25 ℃(经控温室和冷循环仪双层控温)电泳液中电泳23 h后，用Byun等[15]的方法对凝胶进行银染显色。

1.4 KRTAP1-4等位基因序列测定与进化分析

用SSCP方法判定个体基因型是纯合子还是杂合子。若个体基因型全部为杂合子，用Gong等[16]的方法切胶测序；若个体基因型中有纯合子存在，则用PCR扩增产物直接测序。为保证测序结果的准确性，每种基因型均选择3个不同的个体进行测序。

基于山羊、绵羊和人类上所有已鉴定的高硫KAPs序列，用MEGA V5.0构建系统进化树，进化树的置信度以500次自展分析进行重复检验。用于构建系统进化树的高硫KAPs序列为：gKAP13-1(AY510115)、gKAP24-1(MG996011)、gKAP3-1 (NM_001285774)、gKAP11-1(NM_001285767.1)、sKAP13-3(JN377429)、sKAP24-1(JX112014)、sKAP1-2(HQ897973)、sKAP11-1(HQ595347)、sKAP1-1、sKAP1-4(X01610)、sKAP15-1(KX817979)、sKAP26-1(KX644903)、sKAP1-3(X02925)、sKAP2-1(P02443)、sKAP2-3(P02441)、sKAP3-1(P02446)、sKAP3-2(P02444)、sKAP3-3(P02445)、hKAP1-1(NM_030967.2)、hKAP2-1(NM_001123387.1)、hKAP3-1(NM_031958.1)、hKAP11-1(NM_175858.2)、hKAP13-1(NM_181599.2)、hKAP15-1(NM_181623.1)、hKAP16-1(NM_001146182.1)、hKAP23-1(NM_181624.1)、hKAP24-1(NM_001085455.2)、hKAP25-1(NM_001128598.1)、gKAP1-3(JQ772533)、hKAP1-3(NM_030966.1)、hKAP1-4(NM_001257305.1)、hKAP1-5(NM_031957.1)、hKAP2-2(NM_033032.2)、hKAP2-3(NM_001165252.1)、hKAP2-4(NM_033184.3)、hKAP3-2(NM_031959.2)、hKAP3-3(NM_033185.2)、hKAP13-2(NM_181621.3)、hKAP13-3(NM_181622.1)、hKAP13-4(NM_181600.1)、hKAP26-1(NM_203405.1)、gKAP27-1(MN934937)和hKAP27-1(NM_001077711.1)，括号中数据为序列的GenBank登录号，序列名称中的g、s和h分别表示该序列为山羊、绵羊和人类的KAPs序列。用MEGA V5.0比对山羊和绵羊KRTAP1-4基因间的核苷酸序列差异，并分析山羊KAP1-4多肽链的氨基酸组成。

1.5 山羊KRTAP1-4基因的多态性

用GenBank在线BLAST功能比对序列同源性，用Popgen V32.0计算382只陇东绒山羊中KRTAP1-4的等位基因频率、基因型频率、遗传杂合度(He)和有效等位基因数(Ne)，用PIC V0.6软件计算多态信息含量(PIC)。

1.6 相关性分析

用Excel整理382只陇东绒山羊的表型观测数据，用SPSS V22.0软件分析产绒量、绒层高度和羊绒纤维直径3种表型性状间的Pearson相关性，以及KRTAP1-4基因型与羊绒性状的相关性。对KRTAP1-4的优势基因型(在382只陇东绒山羊中的频率>5%)，用一般线性混合效应模型(general linear mixed-effects models，GLMMs)分析基因型与羊绒性状间的相关性。研究表明，出生等级对产绒量、绒层高度和纤维直径3个羊绒性状没有影响(P>0.05)，而父本和性别极显著影响着羊绒性状(P<0.01)。因此在GLMMs模型中，将性别和基因型作为固定效应，父本作为随机效应[17]。由于所有羊只年龄相同(1岁)，且均饲养于同一环境条件，因此模型中没有考虑年龄和环境因素。具体的GLMMs模型为Y=μ+S+G1+G2+e，其中Y为表型值，μ为性状群体均值，S为父本，G1为基因型，G2为性别，e为随机误差。

2 结果与分析

2.1 KRTAP1-4基因的表达谱

RT-PCR发现，KRTAP1-4基因只在陇东绒山羊的皮肤中表达，在心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏中均不表达(图1)。

2.2 KRTAP1-4基因的PCR-SSCP分析

在382只陇东绒山羊中均扩增出1条668 bp的DNA片段。经SSCP分析，在陇东绒山羊上检测到4个等位基因(A、B、C、D)和5种基因型AA、AB、AC、AD和BB(图2)。

2.3 KRTAP1-4基因的进化和核苷酸序列分析

进化分析结果(图3)显示，本研究得到的4个等位基因序列与绵羊的KRTAP1-4序列的相似性较高，表明这些序列就是山羊KRTAP1-4的4个等位基因。

测序分析结果(图4)显示，在382只陇东绒山羊的KRTAP1-4基因中存在1个插入/缺失位点和2个SNPs位点(c.333T>C和c.573C>T)，2个SNPs位于编码区域，均为同义突变；等位基因D的序列长度与绵羊KRTAP1-4的相一致；与等位基因D相比，等位基因A、B和C发生了30 bp碱基(c.223_252insTGCCAACCGATCTCCATCCAGA-CCAGCTGC)的插入，导致其所编码的多肽链中存在10个氨基酸(p.73_82insSCCQPISIQT)的插入。

图4还显示，在山羊KRTAP1-4基因中发现了1个Chi序列(c.14-c.21；5′-CCACCAGC-3′，反向互补序列为5′-GCTGGTGG-3′)和2个Chi-like序列，它们分别位于c.46-c.53(序列为5′-ACTGGTGG-3′，反向互补序列为5′-CCACCAGT-3′)和c.392-c.399(序列为5′-GCACCAGC-3′，反向互补序列为5′-GCTGGTGC-3′)。

2.4 山羊KAP1-4的氨基酸组成

陇东绒山羊KRTAP1-4的等位基因A、B和C都编码192个氨基酸，但等位基因D编码182个氨基酸。在这4条多肽链中，共出现17种氨基酸，其中半胱氨酸含量(物质的量百分比)最高(21.35%～22.39%)，其次为丝氨酸(13.02%～14.06%)和苏氨酸(12.50%～13.02%)。

2.5 山羊KRTAP1-4基因的多态性

在陇东绒山羊上检测到的基因型中，AA、AB、AC和BB为优势基因型，其频率分别为69.37%，18.32%，5.50%和5.76%；AD基因型的频率为1.05%。在发现的等位基因里，A的频率最高(81.81%)，其余3种等位基因B、C和D的频率分别为14.92%，2.75%和0.52%。382只陇东绒山羊的He和Ne值分别为0.25和1.44，PIC值为0.28，说明该群体处于中度多态(0.25

2.6 羊绒性状间的相关性

Pearson相关性分析中，r代表系数，若|r|≤0.3则定义为弱相关，0.3<|r|≤0.7则定义为中等相关，|r|>0.7则定义为强相关；r为负数表示负相关，r为正数表示正相关。本研究3个羊绒性状中，产绒量与平均纤维直径(r=0.324，P<0.001)和绒层高度(r=0.465，P<0.001)呈中等正相关，平均纤维直径与绒层高度呈弱的正相关(r=0.201，P<0.001)。

2.7 KRTAP1-4基因型与陇东绒山羊羊绒性状间的相关性

在382只陇东绒山羊中，由于基因型AD的频率小于5%，所以将其排除在相关性分析之外。相关性分析结果(表2)表明，BB型山羊的产绒量分别较AA、AB和AC型个体高66，38和58 g/只，其绒层高度分别较上述基因型个体高0.3，0.2和0.4 cm；KRTAP1-4的基因型对陇东绒山羊的羊绒平均纤维直径无显著影响(P>0.05)。

表2 KRTAP1-4基因型与陇东绒山羊羊绒性状间的相关性Table 2 Association of KRTAP1-4 genotypes with cashmere fiber traits in Longdong cashmere goats

3 讨 论

本研究发现，在采集的陇东绒山羊6个组织中，KRTAP1-4基因只在皮肤中表达，这与前人对山羊KRTAP20-1[18]、KRTAP20-2[19]和KRTAP15-1[12]的研究结果一致，也与KAPs是羊绒纤维的主要结构成分的研究结果相一致，表明大多数KRTAPs基因只在皮肤中特异性表达。然而，少数KRTAPs基因也在皮肤以外的其他组织中表达，如KRTAP8-1基因在小尾寒羊肝脏、脾脏和肾脏中表达[20]，KRTAP11-1基因在辽宁绒山羊心脏和肝脏中表达[21]，提示KRTAPs的组织表达特征不能一概而论，应针对每一个KRTAP基因专门开展研究。

本研究中，经PCR-SSCP分析，陇东绒山羊KRTAP1-4中有4个等位基因，其中等位基因D的序列长度与绵羊KRTAP1-4的相一致，而等位基因A、B和C的序列发生了30 bp的碱基插入，导致了10个氨基酸的插入，这与Shah等[10]对克沃尔山羊KRTAP1-4的研究结果一致。然而，由于陇东绒山羊中等位基因D和基因型AD的频率很低(分别为0.52%和1.05%)，所以未能研究这种碱基插入对陇东绒山羊羊绒性状的影响。大片段的碱基插入/缺失这种序列变异在KRTAPs基因中较为常见，例如，在陕北白绒山羊KRTAP6-2中存在24 bp(c.119_142delCAGGATACGGCTGTGGATAC-GGTT)的碱基插入/缺失[22]，在绵羊上也报道了这种现象[3]。另外，本研究在陇东绒山羊的KRTAP1-4中还发现了c.333T>C和c.573C>T 2个SNPs位点。虽然它们是同义突变，未引起编码氨基酸的改变。但同义突变可以通过影响蛋白质翻译准确性和折叠结构等多种形式，改变蛋白质功能，进而对表型产生影响[23-24]。对于c.573C>T，等位基因A、C和D在此处的碱基均是胞嘧啶(C)，而等位基因B的碱基是胸腺嘧啶(T)。相关性分析表明，BB型山羊的产绒量和绒层高度均最大，说明此SNP位点影响了绒山羊的产绒量和绒层高度，但是这个SNP通过何种生物学途径影响羊绒性状还需进一步研究。值得注意的是，本研究在陇东绒山羊KRTAP1-4中发现了1个Chi和2个Chi-like序列，前人在山羊KRTAP27-1[25]、KRTAP15-1[12]和绵羊KRTAP2-1[26]等KRTAPs基因上发现了类似现象。Chi序列是一个八聚体，它是大肠杆菌DNA重组的热点序列，能促进10 kb以内的区域发生序列重组[27]。Chi序列中的一个碱基变异便形成了Chi-like序列，它并不会影响重组活性。由此推测，Chi和Chi-like序列可能是KRTAP1-4基因多态性形成的重要机制之一，但这还需要进一步深入研究。

前人已在其他山羊品种中研究了KRTAP1-4基因的多态性。例如，谭遥[28]在西藏绒山羊KRTAP1-4上发现了c.209C>T和c.245C>T 2个SNPs，其中c.245C>T为非同义突变。Shah等[10]在克沃尔山羊、卡吉尔山羊和帕什米纳山羊KRTAP1-4上发现了7个SNPs，其中5个是同义突变。但是上述研究中发现的SNPs，在本研究中均未发现，说明该基因有较丰富的多态性。同时，本研究发现，山羊KRTAP1-4的多态性程度低于绵羊的KRTAP1-4基因。Gong等[9]在美利奴羊、罗姆尼羊、库普沃斯羊和杂种绵羊4个群体的KRTAP1-4基因上检测到9个非同义突变的SNPs位点，这可能与该研究使用的绵羊品种较多且含有杂种绵羊有关。

本研究中，陇东绒山羊KRTAP1-4基因编码的多肽链中，半胱氨酸的含量(物质的量百分比，下同)最高，为21.35%～22.39%，这符合高硫KAPs的典型特征[1]；其次是丝氨酸，含量为13.02%～14.06%。本研究中，陇东绒山羊KAP1-4的半胱氨酸含量高于同属于高硫KAPs类型的KAP15-1(7.4%)[12]和KAP24-1(8.6%～9.0%)[29]，但其丝氨酸含量低于KAP15-1(20.6%～21.3%)和KAP24-1(15.6%)。半胱氨酸作为角蛋白合成的限制性氨基酸之一，与羊毛纤维弹性和弯曲度有一定的相关性[30]。丝氨酸易于发生磷酸化，作为蛋白质翻译后修饰的方式之一[31]，它在细胞信号传导中起主要作用[32]。KAPs中的半胱氨酸和丝氨酸含量对其生物学作用有影响[12,8]。

本研究中，KRTAP1-4的基因型对陇东绒山羊的产绒量和绒层高度有影响，而对平均纤维直径没有显著影响，这种影响可能与性状间的表型相关性有关。因为本研究发现山羊产绒量与绒层高度呈中等正相关，这与对陇东绒山羊KRTAP20-2中的研究结果相一致[19]。本研究中，BB型山羊的产绒量和绒层高度极显著高于其他基因型绒山羊(P<0.01)。因此在今后的育种实践中，要选留BB型个体，从而提高陇东绒山羊的产绒量和绒层高度。在已有KRTAP1家族的研究中，KRTAP1-4的作用与KRTAP1-1和KRTAP1-2一致，但与KRTAP1-3不同。例如，KRTAP1-1基因与辽宁绒山羊的产绒量相关[4]，KRTAP1-2基因与美利奴杂种羔羊的产毛量相关[33]，而Chen等[34]发现，KRTAP1-3的多态性影响了中国美利奴羊的羊毛纤维直径。这可能与这4个KRTAP1家族基因在染色体上的位置有关，因为KRTAP1-4在染色体上的位置与KRTAP1-1、KRTAP1-2较近，而与KRTAP1-3较远。