评估子宫内膜容受性的研究进展

段霞，王治鸿

作者单位：030001 山西 太原，1.山西医科大学；2.山西医科大学第一医院生殖中心

1950年，张明觉先生研究家兔胚胎移植时发现了胚龄与子宫内膜同步化的重要性，并首次提及子宫内膜容受性(endometrial receptivity，ER)，指在特定时间子宫内膜允许胚胎接触、定位、黏附、植入的能力，而这一特定时间段被称为“种植窗(window of implantation，WOI)”，WOI一般在正常月经周期第20～24天或LH峰7～10天[1]。 近年来，ER越来越成为生殖医学专业的研究重点，但其评估和治疗方法研究进展甚微。目前，评估ER方法包括宏观评估(阴道超声检查)、微观评估(子宫内膜活检、基因、分子等)、内分泌测定以及宫腔镜检查等。本文就评估ER的研究进展进行综述，以期为科学研究与临床工作提供参考。

1 宏观评估方法

在ER评估方法中，经阴道多普勒超声具有简便廉价、分辨率高、无创伤以及可重复性等优点，广泛应用于临床。目前ER超声评估指标包括子宫内膜厚度(endometrial thickness，EMT)、容积、类型、血流动力学参数以及蠕动波。

1.1 子宫内膜厚度

EMT是目前评估ER最常见的指标。一项回顾性研究表明，在新鲜体外受精与胚胎移植(in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET)和冻融胚胎移植(frozen-thawed embryo transfer,FET)中诱导排卵日EMT分别≤8 mm、7 mm时，临床妊娠率、活产率显著下降[2]。同时一项Meta分析显示EMT预测临床妊娠准确性较低，EMT >7 mm时灵敏度和特异度分别为99%和3%，受试者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲线下面积为0.57(95%CI:0.52-0.61)，表明临床妊娠与未妊娠妇女EMT比较差异无统计学意义[3]。

1.2 子宫内膜容积

一般认为子宫内膜容积(endometrial volume，EMV)评价ER较EMT更准确。Maged AM等[4]研究发现取卵日和移植日妊娠组EMV较未妊娠组明显升高，差异有统计学意义。一项前瞻性试验也表明EMV≥5 mL时预测ER的灵敏度较高，特异度较低，可作为排除指标[5]。

1.3 子宫内膜类型

根据不同回声状态子宫内膜类型可分为A型(外层高回声，内层低回声，宫腔线高回声)、B型(内层均匀高回声，宫腔线清晰)、C型(均一高回声或等回声，宫腔线不明显)3种。A型内膜种植率和临床妊娠率明显高于B型和C型，而C型内膜似乎不利于胚胎着床[6]。然而另有研究发现子宫内膜类型与活产率无显著关联，不应单独作为取消周期的决定性因素[3,7]。

1.4 子宫内膜血流动力学参数

由于子宫动脉终末分支螺旋动脉血流主要供应子宫内膜，内膜血流及血管化程度更适合评价ER，主要包括螺旋动脉阻力指数(resistance index，RI)和搏动指数(pulsatility index，PI)，子宫内膜下血管化指数(vascularization index，VI)、血流指数(flow index，FI)、血管化血流指数(vascularized blood flow index，VFI)。 PI、RI越小，子宫和卵巢血流灌注越好。Li Z等[8]研究表明临床妊娠结局与子宫内膜下PI无相关性，与RI呈负相关，与内膜下微血管分布呈正相关。一项Meta分析表明取卵日子宫内膜下FI与高临床妊娠率有关，新鲜胚胎移植日子宫内膜下FI与高临床妊娠率无关，而临床妊娠妇女子宫内膜VI、VFI高于非临床妊娠妇女[9]，总之取卵日内膜下FI和移植日VI、VFI可能与IVF-ET妊娠发生有关，有助于确定移植的合适时机。

1.5 子宫内膜波状活动(蠕动波)

正常女性月经周期中子宫平滑肌受雌孕激素调节引起类似胃肠道蠕动的波动称为子宫内膜蠕动波，可控制胚胎移动与定位。一般蠕动波频率≤2波/min时临床妊娠率最高，≥3波/min时临床妊娠率显著降低。

2 微观评估方法

2.1 胞饮突

胞饮突是子宫内膜上皮顶端微绒毛水肿融合形成的突起，易受外源性雌孕激素影响，在种植窗口期参与囊胚与子宫内膜黏附过程，是ER状态的标志。2017年Jin XY等[9]报道了126例接受FET妇女的胞饮突并形成发展中胞饮突(DP)和发育完全胞饮突(FDP)的百分数评分系统，发现高胞饮突指数评分组胚胎着床率和妊娠率也较高。由于胞饮突结构需要在扫描电子显微镜下观察，且为侵入性检查，价格昂贵，尚处于实验阶段，目前缺乏统一评价标准。

2.2 ER阵列

ER阵列(endometrial receptive array，ERA)是基于238个基因表达的定制阵列，与诊断功能容受性子宫内膜的计算预测因子相结合，无论其组织学外观如何，都可通过比较自然周期或激素替代治疗周期测试样本和对照样本的转录图谱来确定患者ER状态，判断患者的个体化种植窗，进而进行个体化胚胎移植(personalized embryo transfer，pET)[10]。ERA应用的微阵列技术原理是将被检测生物细胞或组织中大量标记的核酸序列与已知序列的基因探针进行杂交，通过检测相应位置的杂交探针来实现基因信息的快速检测[11]。

ERA分子基因检测技术的引入对不孕症患者评估ER以及进行pET具有较高的临床指导价值。2013年Ruiz-alonso M等[10]在一项前瞻性多中心介入性临床试验中，选取85例反复植入失败(repeated implantation failure，RIF)患者作为研究组，25例普通育龄期妇女作为对照组，根据ERA指导提供“个性化胚胎移植”，导致研究组最终达到与对照组相似的妊娠率(50.0%)和着床率(38.5%)，表明如果胚胎和“容受性状态”子宫内膜之间实现同步，子宫内膜源性RIF患者可以达到正常的着床率和妊娠率。2014年Ruiz-alonso R等[12]报告了一对7次IVF失败夫妇经过pET治疗后随即成功妊娠并足月分娩的个案，随后进行试点研究，17例接受卵母细胞捐献的患者(常规胚胎移植失败多达6次)经pET治疗后，临床妊娠率达到了60%，而在ERA诊断的非接受性子宫内膜中，常规ET后妊娠率只达到了19%。这些案例报告之后，研究者们开始使用ERA指导临床实践中的pET。2015年一项针对印度人群的回顾性研究收集并分析了3组人群[RIF组、一次周期失败组和子宫内膜萎缩(<6 mm)组]的ERA数据，结果显示27.5% RIF患者的WOI有移位，而一次周期失败组只有15%移位[13]；RIF组经过pET治疗后的总持续妊娠率和着床率与一次周期失败组相似。有趣的是，ERA测试显示25%的萎缩子宫内膜组出现了移位WOI，尽管EMT<6 mm，pET后妊娠率可达66.7%。据报道无反应的4 mm子宫内膜也出现类似的情况[14]。2017年一项回顾性分析评估了50例RIF患者中有24% WOI移位，pET后达到了50%妊娠率[15]，与先前研究结果类似。因此，ERA指导的pET似乎可显著改善不明原因RIF患者妊娠率和着床率。

然而，即使上述研究肯定了ERA的临床价值，仍有部分研究中心认为ERA目前是一项不成熟的技术，否认其临床价值。2018年Tan J等[16]观察到，和普通ET相比，经pET后虽可得到较高的妊娠率和持续妊娠率(66.7%vs 44.4%，58.3% vs 33.3%)，但差异无统计学意义；2019年Cozzolino M等[17]进行回顾性多中心队列研究发现，ERA测试的使用似乎没有显著改善RIF组的妊娠结局；其他回顾性研究也没有发现RIF患者pET与ET之间的临床差异有统计学意义[18]。以上研究样本量均较少，且为回顾性研究，故仍需大型前瞻性研究来进一步阐明ERA检测技术在不孕症患者中的作用。总之，ERA是目前诊断ER最客观、最准确的检测技术，同时引入了个体化WOI及pET概念，体现了未来精准医疗在生殖医学领域的重要性，有望成为评估ER以及诊断不孕症的金标准。

2.3 子宫内膜微生物组与免疫

近几年研究发现微生物群落的平衡对器官生理功能发挥着重要作用。最新研究表明子宫内膜存在常驻微生物群，与宫颈阴道菌群只有30%的一致性[19]。 基于测序技术发展微生物群落目前被定义为存在于子宫内膜水平微生物及其基因组总和。Moreno I等[20]通过16S rRNA序列测定技术检测了多达191个细菌属分类单位，最后以乳酸杆菌为主和非乳酸杆菌为主微生物组进行区分，发现非乳酸杆菌为主微生物组女性的着床率、妊娠率和持续妊娠率明显较低。

随着肠道微生物群及其代谢产物和宿主免疫相互作用的发现，研究者们开始探索在胚胎着床和胎盘形成过程中子宫内膜微生物群与子宫免疫的相互作用[21]。人体子宫内膜包含大量免疫细胞，如T细胞、自然杀伤细胞和抗原呈递细胞，可分泌各种免疫分子和细胞因子，在胚胎着床、内膜蜕膜化及维持妊娠中发挥重要作用[22]。越来越多的证据表明子宫内膜免疫依赖于Th1细胞、Th17细胞、先天淋巴细胞与抑制性Foxp3+ Treg细胞的相互作用[23]。先天免疫系统通过模式识别受体感知病原体相关分子模式，如Toll样受体、RIG-I样受体以及NOD样受体[24]。激活Toll样受体可诱导核因子-κB信号通路，通过各种衔接蛋白启动炎症级联反应以产生适应性免疫反应[25]。2021年Basatvat S等[26]通过定量实时PCR比较健康妇女接受前(LH+2)和接受性(LH+8)子宫内膜活检的基因表达水平，发现接受性子宫内膜活检(LH+8)中的Toll样受体-5和血管内皮细胞生长因子-β显著下降；但RIF妇女子宫内膜活检组织中的Toll样受体-9基因显著上调。目前还需要研究来进一步阐明子宫内膜微生物群生物多样性对生殖的影响、子宫内膜环境中微生物定植和存活的机制以及微生物免疫潜在激活的所有信号通路等。

2.4 分子标记物

2.4.1 同源盒基因A 同源盒基因A(Homeobox gene A， HOXA)是含有同源盒的转录调节因子，具有高度保守的同源域结构，其中HOXA10在月经周期子宫内膜发育中起核心作用， HOXA10表达与雌激素和孕激素水平有关，黄体期表达增加，并在WOI达到峰值水平。HOXA10可改善ER，并接收胚泡信号，修饰子宫内膜使其蜕膜化，使滋养层侵入和胎盘形成成为可能，可作为良好的ER标志物。近年来HOXA10的上游调控得到了验证，S期激酶相关蛋白2 (S-phase kinase associated protein 2，SKP2)属于F-box蛋白家族成员，SKP2通过促进HOXA10的降解抑制HOXA10蛋白质稳定性，进而抑制子宫内膜增殖和卵泡黏附，降低ER， SKP2也被定义为ER标志物，并作为不孕症诊断和治疗靶点[27]。

2.4.2 白血病抑制因子 白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor，LIF)在胚胎-子宫内膜相互作用、基质细胞蜕膜化、滋养层侵袭、子宫白细胞浸润、胚泡生长、前列腺素合成以及胚胎着床过程中发挥关键作用[28]。最新研究发现LIF基因在健康育龄妇女中接受期子宫内膜活检较接受前表达上调，然而尚未发现健康女性与IVF失败个体子宫内膜活检LIF mRNA表达变化，与先前报道不孕妇女子宫冲洗液中LIF浓度明显低于健康女性结果不同。LIF的具体作用机制需进一步探讨[26]。

2.4.3 整合素 整合素(integrin，ITG)是由α、β亚基非共价连接组成的跨膜糖蛋白家族，参与细胞间以及细胞与细胞外基质间的黏附，同时介导胚胎着床，决定胚胎侵入性。整合素αvβ3及其配体骨桥蛋白在整个正常月经周期协同表达，且于分泌中期表达增多，与种植窗口期协同一致。相关研究表明不明原因不孕患者子宫内膜整合素β3 mRNA表达水平明显低于育龄妇女(P=0.043)[29]。分泌型磷酸蛋白-1，也称骨桥蛋白，与子宫内膜上皮细胞表面整合素结合，与LIF、载脂蛋白D和瘦素相互作用，刺激细胞-细胞和细胞-细胞外基质的黏附和通讯，在胚胎着床过程中发挥重要作用，相关研究也证实各种生殖障碍妇女分泌中期子宫内膜中骨桥蛋白失调[30]。近几年ITGB8也在上皮细胞生长调控中被报道，ITGB8通过激活子宫下游信号分子黏着斑激酶促进子宫内膜上皮细胞的蜕膜化以及滋养层细胞的侵袭进而获得胚胎着床[31]。

2.4.4 基质金属蛋白酶 基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs )是一类可水解细胞间基质与细胞膜的蛋白水解酶，与多种组织重建的生理和病理过程有关，如月经发生、排卵、乳腺发育、肾脏炎症、甲状腺疾病及多种肿瘤发生。已证实MMP-9在子宫内膜黄体中期特异性表达增加，有助于胚胎植入。目前MMPs研究尚少。

2.4.5 微小RNAs 微小RNAs是由细胞通过外泌体、凋亡小体、脂质结合体或RNA结合复合蛋白分泌； Kuokkanen S等[32]研究发现，分泌中期子宫内膜上皮细胞miR30b、miR-30d以及miR-31 较增殖后期表达上调[33]。近期Chen CH等[34]创新性通过panel chip多基因表达谱平台并借助实时PCR技术来筛选可能成为种植窗标记物的微小RNAs。该研究对36例不孕女性的子宫内膜进行活检的同时进行ERA测试，最终鉴定出6种在RIF组(n=8)和对照组(n=17)中差异表达的微小RNAs，分别是 hsa-mir-155-5p、hsa-mir-20b-5p、hsa-mir-330-5p、hsa200 mir-718、hsa-mir-940以及 hsa-mir-144-3p，与ERA测试结果一致，表明RIF组和对照组子宫内膜表达具有差异性。研究中RIF定义为2次IVF失败，而不是3次，只有极少数(13/36，36%)的受试妇女是因RIF接受IVF治疗，其余(23/36，64%)为对照组，均为首次移植周期。

2.4.6 其他相关因子 集落刺激因子(colony stimulating factor，CSF-1)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF) 、细胞间黏附分子(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)以及免疫球蛋白超家族(immunoglobin-super family,IG-SF)等也被认为与ER相关，但其具体作用还须进一步研究。

2.5 蛋白组学与脂质组学

2020年Kasvandik S等[35]使用质谱蛋白质组学技术从6名健康育龄妇女分泌期子宫腔液中检测到3 158种蛋白质，其中367种在分泌早期子宫内膜向中期转变时发生了显著的蛋白质组学变化(P<0.05)；又用靶向技术发现21种蛋白质在对照组早期和RIF组中期内膜之间水平相似，表明RIF组WOI位移；也证明蛋白检测能较好地评估ER。

胞外囊泡作为细胞间信号传递信使在胚胎滋养层细胞与上皮细胞相互作用中发挥重要作用，促进胚胎着床。一项人类外泌体实验已证实胞外囊泡参与分泌中期子宫内膜功能表达[36]。2019年一项病例对照研究从41例接受全冷冻周期治疗的患者中收集子宫内膜液样本，通过分析内膜液中脂质成分，并构建ROC曲线，曲线下面积为84.0%，表明子宫内膜液脂质组学特征可用于确定WOI确切时间，可有效降低反复种植失败发生率[37]。

3 其他评估方法

3.1 内分泌测定

雌激素(estrogen，E2)和孕激素(progestogen，P)通过相应受体调节子宫内膜，在胚胎植入中起主导作用，还涉及多种因子表达，如同源盒转录因子、前列腺素以及生长因子。E2与子宫基质细胞和上皮细胞受体结合，通过旁分泌、自分泌调节细胞增殖。Ncoa6， 雌激素受体的辅激活剂，正常生理条件下可增强受体泛素化并加速其降解，减弱E2灵敏度，有助于子宫内膜容受状态开放，目前E2灵敏度调节ER的潜在机制尚不清楚，相反，Ncoa6的缺失导致E2过度响应诱发植入失败[38]。孕激素受体在女性卵巢、子宫内膜中均有表达，且受P、E2、胰岛素、胰岛素生长因子-1等激素调节，在生长发育中发挥重要作用。有研究表明不明原因不孕患者子宫内膜细胞孕激素受体呈低表达[39]。总之E2、P及其受体是决定ER窗口期的关键因素，其具体分子机制尚未明晰。

3.2 宫腔镜评估ER

宫腔镜检查目前常用于IVF-ET失败、实验室可获得优质胚胎却不能成功妊娠的患者。当发现子宫内膜肌瘤、息肉以及宫腔粘连时可予相应处理，对于宫腔无明显病变者可于种植窗口期进行血管及腺体检查来评估ER。然而近期一项研究提示常规宫腔镜检查并未改善超声提示宫腔形态正常的不孕患者IVF妊娠结局[40]。Smit JG等[41]研究也表明超声提示宫腔形态正常的RIF患者在IVF前进行宫腔镜检查并不能显著改善活产率。因此目前认为单纯宫腔镜检查并未改善ER，在临床实践中不常规使用。

综上，如何提高临床妊娠率一直是生殖领域研究的难点和热点，良好的ER依然是着床成功的关键。评价ER方法众多，但仍缺乏评估金标准，各种无创和有创评估手段仍需更多循证医学证据来支持。