基于网络药理学联合差异分析及分子对接探讨养阴清肺汤干预慢性阻塞性肺疾病的作用机制

袁梓珂，蔡孟成，金永生

0 引 言

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmoriary disease，COPD)是一种以气流阻塞为主要特征的慢性支气管炎和(或)肺气肿，严重者可发展为肺心病和呼吸衰竭[1-2]。流行病学调查研究显示：我国40岁以上人群COPD的患病率高达9.4%[3]，现代医学应用糖皮质激素及支气管扩张药进行干预。因此，研究COPD具有重要意义。目前，虽然可以改善患者的临床症状但都存在着一些副作用。而传统中医药在干预COPD方面具有不良作用小，起效平稳等特点，越来越受到重视。养阴清肺汤出自《重楼玉钥》，由生地、麦冬、甘草、玄参、贝母、丹皮、薄荷、白芍八味药物组成，具有养阴润燥，清肺利咽的功效，主治患者干咳少痰。临床研究表明养阴清肺汤单独干预或联合常规治疗干预COPD均可改善患者肺功能，缓解临床症状，并且安全性较好[4-6]，但目前研究尚未明确养阴清肺汤干预COPD的物质基础与作用机制。本文运用网络药理学结合差异分析及分子对接技术探讨养阴清肺汤干预COPD可能的物质基础与作用机制，为临床推广提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 养阴清肺汤潜在活性成分及靶点的获取利用BATMAN-TCM数据库(Bioinformatics Analysis Tool for Molecular mechanism of Traditional Chinese Medicine http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/index.php/Home/Index/index)根据cut-off>48，P<0.05获取养阴清肺汤的活性成分和作用靶点。

1.2疾病靶点的获取以"chronic obstructive pulmoriary disease"为关键词，利用GeneCard数据库(http://www.genecard.org/)获取COPD的靶点。

1.3成分-靶点网络图的构建利用R软件维恩图将1.1中的潜在活性成分靶点与1.2中的疾病靶点进行交集，获得交集靶点。利用Perl程序prepareCyto.pl获得潜在活性成分-靶点网络文件，将该文件导入Cytoscape软件构建成分-靶点网络图。

1.4GEO芯片差异基因获取利用GEO数据库检索“chronic obstructive pulmoriary disease(COPD)”，物种选择人类，选择基因数据，下载基因矩阵与平台数据文件，利用R软件绘制火山图。将1.3中获得的潜在活性成分靶点-疾病靶点的交集基因与GEO数据库获得的差异基因(P<0.05及-1

1.5GO与KEGG富集分析将1.4中的公共靶点导入Cytoscape软件，利用ClueGO进行GO和KEGG富集分析，其中GO分析主要分析生物过程(BP)和分子功能(MF)两个部分。BP、MF的Evidence选择All，物种选择人类，GO与KEGG的P<0.05，其余保持默认设置。

1.6分子对接利用1.3中度值较高的潜在活性成分与1.4中的公共靶点进行分子对接，配体来源于Pubchem数据库，受体来源于PDB数据库，利用Pymol软件去掉受体的配体，利用Autodock软件对配体和受体进行去水、加氢、加电荷操作，保存为pdbqt格式，利用Autogrid和Autodock将配体和受体进行对接，利用Pymol软件将结果可视化。

2 结 果

2.1 养阴清肺汤潜在成分获取与靶点预测利用BATMAN数据库根据cut-off>48获得养阴清肺汤潜在活性成分95个，靶点498个。活性成分主要包括：L-天门冬酰胺(L-Asparagine)、薄荷酮(Piperitone)、3-甲基-6,7,8-三氢吡咯[1,2-A]嘧啶-2-酮(3-Methyl-6,7,8-Trihydropyrrolo[1,2-A]Pyrimidin-2-One)、延胡索乙素(Tetrahydropalmatine)、丙酮醛(Methylglyoxal)、腺苷(Adenosine)、胸腺嘧啶(Thymine)、那维定(Narwedine)、α-三羟基粪甾烷酸(Alpha-Trihydroxy Coprostanic Acid)和γ-氨基丁酸(Gamma-Aminobutyric Acid)等，作用靶点主要包括：多巴胺受体D2(dopamine receptor D2,DRD2)、大麻素受体1(cannabinoid receptor 1,CNR1)、雌激素受体1(estrogen receptor 1,ESR1)、胆固醇酰基转移酶2(sterol O-acyltransferase 2，SOAT2)、雄激素受体(androgen receptor，AR)、糖化血红蛋白(glycated hemoglobin |glycosylated hemoglobin,HDA1C)、甲状腺过氧化物酶(thyroid peroxidase,TPO)、孕酮受体(progesterone receptor,PGR)、KQT样亚家族成员1(potassium voltage-gated channel subfamily Q member 1，KCNQ1)等。

2.2疾病靶点获取从GeneCard数据库中获得COPD的靶点6577个。

2.3成分-靶点网络图构建将潜在活性成分靶点与疾病靶点进行交集，蓝色代表疾病靶点，红色代表药物靶点，交集获得公共靶点237个，见图1。利用Cytoscape构建的成分-靶点网络图，见图2。其中红色菱形代表潜在活性成分，紫色圆形代表靶点，连线代表潜在活性成分与靶点的作用关系。图2中有化合物89个，靶点237个，边516条。度值前9名的化合物与作用靶点见2.1主要活性成分与主要作用靶点。

图1 潜在活性成分靶点-疾病靶点交集维恩图

图2 成分-靶点网络图

2.4GEO芯片差异基因获取利用GEO数据库检索GSE148877芯片数据，筛选得到107个样本，其中观察组样本79个，对照组样本28个，获得P<0.05及-1

2.5GO与KEGG富集分析GO富集分析结果显示养阴清肺汤干预COPD的生物过程包括：谷胱甘肽衍生物代谢过程、氧化还原酶活性。分子功能包括：谷胱甘肽过氧化物酶活性、乙醇脱氢酶活性，锌依赖性、类固醇δ异构酶活性。KEGG富集分析结果表明养阴清肺干预COPD的作用机制包括：谷胱甘肽代谢、糖异生/糖酵解和药物代谢。见图4。

a：生物过程;b:分子功能;c:通路富集分析

2.6分子对接利用Pubchem下载度值较高的活性成分薄荷酮的3D结构，利用PDB数据库分别下载ADH1C、GSTT1以及GSTA1的蛋白结构(PDB号分别为：1HT0、2C3T、3I69)，分子对接结果显示薄荷酮与ADH1C、GSTT1以及GSTA1的结合能分别为-3.83、-3.54和-2.61 kcal/mol，一般认为配体与受体结合的构象稳定时能量越低发生作用的可能性越大[7]。说明薄荷酮与3个关键靶点具有一定的结合能力，分子对接模式图见图5。

a：薄荷酮-ADH1C分子对接模式图;b：薄荷酮-GSTT1分子对接模式图;c：薄荷酮-GSTA1分子对接模式图

3 讨 论

烟尘吸入是COPD的危险因素，中医认为烟尘吸入损耗肺阴、伤及肺液，致使阴虚肺燥，当养阴清肺。养阴清肺汤是治疗阴虚肺燥的代表方，临床研究表明：养阴清肺汤可以改善COPD患者临床症状与肺功能指标[8]。并且Meta结果表明，养阴清肺汤联合常规治疗能提高临床疗效[5]。从中医角度上，养阴清肺汤方中生地、玄参、麦冬养阴润燥，清肺解毒，为君药；白芍助君药增强养阴之功，丹皮清热凉血增强清肺之能，为臣药；贝母清痰利心肺，薄荷开肺利咽喉，共治咳嗽，为佐药；甘草调和诸药，泻火解毒，为使药，这些形成了中医干预COPD的机制。现代研究表明养阴清肺汤具有调节免疫功能、抑制炎症反应、促进组织修复的作用[9-10]，这些与现代医学通过抗炎、改善微循环、缓解平滑肌痉挛、调节机体免疫功能改善COPD患者临床症状的治疗原则相一致[11]。但是，其潜在的活性成分与作用靶点有待探究。本文利用网络药理学联合差异分析发现：养阴清肺汤干预COPD的潜在活性成分包括薄荷酮、延胡索乙素、腺苷等潜在靶点，包括ADH1C、GSTT1与GSTA1。这体现了中医药多成分多靶点的作用特点。

现代研究表明薄荷酮具有抗炎、利胆、促渗等作用[12]。延胡索乙素通过抑制肺纤维化，抑制炎症因子、减少氧化损害的作用[13]。腺苷衍生化合物对COPD小鼠气道炎症有明显抑制作用[14]。综上，这些潜在活性成分可能通过协同作用共同干预COPD。薄荷酮、延胡索乙素、腺苷等物质可能通过抗氧化或抗炎等机制来干预COPD。体现了中医药多成分干预疾病的特点。

本研究差异分析结果显示：ADH1C、GSTT1、GSTA1是养阴清肺汤干预COPD的关键基因。研究表明，COPD患者如果长期大量接触乙醇会损害黏液纤毛，从而恶化患者的肺功能，最终提高患者的死亡率。ADH1C对酒精介导的气道功能改变机制可在一定程度上干预COPD，维持患者肺功能不进一步恶化[15]。而GSTT1与COPD的发生具有一定的关联，有研究表明GSTM1/GSTT1组合缺失基因型可能会显著增加中国人群COPD发生的风险[16-18]。并且有研究推测GSTA1在患者气道中的过表达对气道壁细胞具有保护作用[19]。所以养阴清肺汤通过作用于ADH1C、GSTT1、GSTA1等靶点对COPD患者进行一定的干预，体现了中医药干预疾病多靶点多机制的特点和优势。

GO和KEGG富集分析表明：养阴清肺汤干预COPD的机制主要通过调节谷胱甘肽代谢来进行，而谷胱甘肽是细胞内的主要抗氧化物[20]；此外，养阴清肺汤还能通过调控氧化还原酶活性对氧化应激反应进行调节。养阴清肺汤通过这些氧化机制的调控来对COPD进行干预。分子对接结果表明养阴清肺汤的主要化学成分薄荷酮对于3个关键基因ADH1C、GSTT1、GSTA1均有一定的结合能力，也为养阴清肺汤通过关键靶点干预COPD提供了依据。

综上所述，养阴清肺汤干预COPD的潜在活性成分可能是薄荷酮、延胡索乙素、腺苷等物质，这些成分可能通过抗氧化和抗炎等机制来干预COPD。而薄荷酮可以通过作用于ADH1C、GSTT1、GSTA1靶点发挥调节谷胱甘肽代谢及氧化应激通路发挥干预COPD的作用。但本研究仍存在一定的局限性，如潜在活性成分在体内的代谢情况、潜在活性成分在中药中的含量未进行深入探究。但本研究结果可以为日后COPD的临床药物的研发和相关通路的探索提供一定的理论依据。