药食用菌新品种保护及DUS测试指南研制现状与展望

2022-02-24 00:15刘晓柳侯凤飞戴甲木张水寒
中草药 2022年4期
关键词:羊肚食用菌性状

刘晓柳,钟 灿,谢 景,侯凤飞,戴甲木,张水寒,金 剑*

·综 述·

药食用菌新品种保护及DUS测试指南研制现状与展望

刘晓柳1, 2,钟 灿1, 2,谢 景1, 2,侯凤飞3,戴甲木4,张水寒1, 2,金 剑1, 2*

1. 湖南中医药大学中医药研究院,湖南 长沙 410208 2. 湖南省中医药研究院中药研究所,湖南 长沙 410013 3. 湖南补天药业股份有限公司,湖南 长沙 410017 4. 湖南省茯苓工程技术研究中心,湖南 长沙 410017

药食用菌是具有多种生物学功能的重要生物类群。近年来,我国越来越重视药食用菌的研究和利用,药食用菌产业快速发展,新品种保护以及品种权等问题成为影响产业发展的关键因素。介绍了我国农业农村部颁布的13个药食用菌类DUS[特异性(distinctness)、一致性(uniformity)和稳定性(stability)]测试指南,对农业农村部药食用菌DUS测试指南的范围、颁布时间、主要内容、提交材料要求和测试性状等进行了解读和分析,概述了药食用菌DUS测试指南研制及测试技术研究现状,论述了药食用菌新品种的发展历程及申请授权情况,对药食用菌新品种保护和DUS测试技术发展提出建议。

药食用菌;DNA分子标记技术;特异性;一致性;稳定性;品种权

新品种保护是新品种种质资源、种植、加工等一系列产业化过程的重要基础[1]。特异性(distinctness)、一致性(uniformity)和稳定性(stability),简称DUS,是新品种评价的关键指标[2]。特异性是指1个品种有1个以上性状明显区别于已知品种;一致性是指1个品种的特性除可预期的自然变异外,群体内个体间相关的特征或特性表现一致;稳定性是指1个品种经过反复繁殖后或在特定繁殖周期结束时,其主要性状保持不变[3]。新品种测试简称DUS测试,是指根据相关测试技术标准,通过田间种植或室内分析实验,对品种进行特异性、一致性和稳定性评价的过程,是新修订的《种子法》中确定的品种管理的基本技术依据[4],是我国实行新品种保护制度的核心技术要件[5]。随着新品种保护工作的进步与发展,新品种DUS测试工作的规范化与标准化变得越来越重要。

我国1999年4月23日正式加入国际植物新品种保护联盟(International Union for the Protection of New Varieties of Plants,UPOV)成为UPOV第39位成员国,当日即开始受理国内、外植物新品种权的申请[6]。2021年4月23日是我国加入UPOV的第22个周年纪念日。22年来,我国植物新品种保护事业从无到有,各级农业部门与其事业单位创造性地开展工作,使植物新品种保护事业取得了长足发展,呈现出蓬勃向上发展的可喜局面。随着品种保护专门机构逐步完善,农业部于2013年12月27日发布的《主要农作物品种审定办法》规定审定品种必须具备DUS[7]。2000年农业部植物新品种测试中心成立,并在全国10大生态区设立首批14个测试分中心,每年承担测试任务总量都在3000件以上,有效支撑了品种权的授权工作。目前,已在全国建立1个DUS测试总中心、27个分中心和6个专业测试站[8];发布了200多种农作物新品种DUS测试指南和18种农作物新品种DNA指纹图谱鉴定技术标准,制定了13个药食用菌DUS测试指南,建成了包含16 000多个品种的表型、图像和DNA指纹图谱的品种数据库[9],为品种保护及品种管理提供强有力的技术支撑与保障[10]。

药食用菌多为菌物中形成大型子实体的一类真菌,以担子菌为主,少数为子囊菌[11]。我国现有食用菌936种[12]、药用菌473种[13],药食两用250余种[14]。随着人们对药食用菌健康保健功能理解和对于药食用菌中有效成分研究的深入,药食用菌作为一种健康食品日益受到人们的重视[15]。本文对农业部科技发展中心药食用菌类DUS测试指南进行综述和分析,为我国研制药食用菌DUS测试指南相关技术标准提供参考,以促进药食用菌新品种保护和产业发展。

1 药食用菌新品种保护现状

1.1 药食用菌新品种保护发展历程

目前我国没有专门针对药食用菌新品种保护的制度,药食用菌新品种纳入植物新品种保护管理之中,其保护发展历程见图1。植物新品种是世界贸易组织承认的知识产权形式之一,属于国际知识产权保护条约保护范围[16]。1961年12月基于《保护植物新品种国际公约》在巴黎的签订,UPOV正式成立,UPOV成立至今有74个成员国[17]。通过各个国家对UPOV公约的实践,以及生物技术的进步,同时为了加大对品种权的保护,于1972、1978、1991年对其进行了修改,相较于UPOV公约1978年文本,1991年文本更大程度保护育种者权益[18]。1997年3月20日国务院正式发布《植物新品种保护条例》,标志着我国在植物新品种培育领域的知识产权保护制度正式建立[19]。多年来,与国际通行的植物品种保护制度完全不同,我国的主要作物品种实行的是审定和认定制度[20]。前者注重评价的是品种的经济性状,后者注重鉴定的是知识产权归属。1997年《新品种保护条例》颁布实施以来,有效调动了育种者的积极性,促进了优良品种的创新和推广应用[21]。

图1 药食用菌新品种保护的发展历程

1.2 药食用菌现有保护新品种

随着植物新品种保护工作的推进,截至2019年12月底,农业农村部共受理植物新品种申请33 803件,授予品种权13 959件[22]。从2017年至今,我国植物新品种权申请量连续位居世界第1位,已成为知识产权保护大国[23]。就已发布的11批农业植物品种保护名录,受保护的植物种类达191个属(种),其中药食用真菌15个种属,占总的农业保护品种的5%[24],已获批的品种有白灵侧耳中农1号,羊肚菌的川羊肚菌1号、川羊肚菌3号、川羊肚菌4号、川羊肚菌5号、川羊肚菌6号,香菇的HOKSY8号菌、沪香F2、沪香F3、申香215,黑木耳的黑尊3号、黑尊4号、黑尊5号以及灵芝的仙芝2号、禅芝、峨芝(表1)。余下几个种属基本是在2018年开始进行新品种保护申请,农业农村部未见有品种权授权公告。药食用菌品种保护开始的较其他物种晚,白灵侧耳于2005年作为第1个药食用菌被纳入植物新品种第6批保护名录,仅占第1~6批受保护品种种属总量的1.6%;往后10年第10批品种保护名录公布,增加了5个药食用菌种属,占比增加至4.3%;2019年第11批增加了9个种属,占比增加至7.8%。同时UPOV数据统计显示,截至2021年6月12日,UPOV制定并颁布了335个属和种的植物新品种DUS测试指南以及菌类新品种DUS测试指南3个,为双孢蘑菇、香菇[25]、平菇,占比不到1%[26]。综合农业农村部和UPOV数据来看,虽然药食用菌的保护种属数量总体上呈递增趋势,但纵观所有受保护植物新品种,受保护药食用菌数量少,品种少;从2005—2016年、2016—2019年的数据空白显示药食用菌受保护品种增长间断且缓慢。

表1 截至2021年受保护药食用菌品种

Table 1 Protected medicinal and edible fungi varieties until 2021

序号品种名基原物种分类公开时间已获批品种 1白灵侧耳白灵侧耳Pleurotus eryngii var. tuoliensisC. J. Mou担子菌门侧耳科2005年第6批中农1号 2羊肚菌 梯棱羊肚菌Morchella importuna M. Kuo, O’Donnell & T. J. Volk和六妹羊肚菌M. sextelata M. Kuo子囊菌亚门2016年第10批川羊肚菌1号、川羊肚菌3号、川羊肚菌4号、川羊肚菌5号、川羊肚菌6号 3香菇香菇Lentinula edodes Berk. Pegler担子菌门光茸菌科2016年第10批HOKSY8号菌、沪香F2、沪香F3、申香215 4黑木耳黑木耳Auricularia auricula-judae Bull. Quel.担子菌门木耳科2016年第10批黑尊3号、黑尊4号、黑尊5号 5灵芝赤芝Ganoderma lucidumLeyss. ex Fr. Karst.或紫芝G. sinense Zhao, Xu et Zhang真菌门多孔菌科2016年第10批仙芝2号、禅芝、峨芝 6双孢蘑菇双孢蘑菇Agaricus bisporus J. E. Lange Imbach 担子菌门蘑菇科2016年第10批— 7金针菇金针菇Flammulina velutipes Curtis, Singer担子菌门口蘑科2019年第11批— 8蛹虫草蛹虫草Cordyceps militaris L. Fr.子囊菌门麦角菌科2019年第11批— 9长根菇长根菇Hymenopellis raphanipes Berk. Pegler & T. W. K. Young担子菌门膨瑚菌科2019年第11批— 10猴头菌 猴头菇Hericium erinaceus Bull. Pers担子菌门2019年第11批— 11毛木耳毛木耳Auricularia polytricha Mont. Sacc担子菌亚门木耳科2019年第11批— 12蝉花蝉花Isaria cicadae Miq. 子囊菌门虫草科2019年第11批— 13真姬菇 真姬菇Hypsizygus marmoreus Peck H. E. Bigelow担子菌门离褶伞科2019年第11批— 14平菇 平菇P. ostreatus Jacq. P. Kumm担子菌门侧耳科2019年第11批— 15秀珍菇 秀珍菇P. geesteranus Jandialik担子菌门2019年第11批—

“—”表示没有已获批品种

“—” indicates that there are no approved varieties

2 药食用菌DUS测试指南研究进展

2.1 发布现状

DUS测试指南既是判定测试品种是否属于新品种,提供植物新品种保护判定的可靠依据,也是指导测试机构开展DUS测试工作的技术手册[27]。农业农村科技发展中心已经公布209个植物属或种的DUS测试指南,菌类15种。由图2可看出花卉所占比例最大,占全部DUS测试指南的29%;其次是果树和蔬菜,分别占20%、17%;然后是大田作物(15%)、药用植物(8%)和牧草(5%);菌类占比(6%)仅高于牧草。相比于其他植物新品种保护,药食用菌保护力度较低,保护进度较慢[28]。

图2 药食用菌DUS测试指南分布

2.2 内容组成

DUS测试指南是指导DUS测试开展工作的行动指南。我国DUS测试主要有官方测试、现场考察和育种人自主或委托测试等方式[29]。目前我国大部分DUS测试指南是在参考UPOV指南的基础上制定的[30]。农业部科技发展中心发布的药食用菌DUS测试指南由10个部分组成,即范围,规范性引用文件,术语和定义,符号,繁殖材料的要求,测试方法,特异性、一致性和稳定性结果的判定,性状表,分组性状和技术问卷。其中,繁殖材料的要求,测试方法,特异性、一致性和稳定性结果的判定以及性状表是测试指南制定中尤为重要的部分。

2.3 制定繁殖材料的要求

繁殖材料的要求是对提交的待测品种繁殖材料的形式、数量、规格、保存条件等作出规定。在农业农村部发布的现行13种菌类DUS测试指南中,繁殖材料主要以菌种或母种2种形式提供,提交的母种或菌种数量至少为3支。繁殖材料的具体要求为均使用规格(180~200 mm)×(18~20 mm)的母种试管;采用马铃薯葡萄糖琼脂培养基培养保存;要求提供外观整洁,菌落边缘整齐,菌丝活力强的母种平板。除羊肚菌属和金针菇保证送抵时菌龄为7~10 d外,其他均为10~14 d(表2)。DUS测试指南也要求当测试单位收到菌种后,应立即扩繁留存菌种,并妥善保存,已备复查,如有特殊保藏要求,应提供保藏的详细说明。提交的材料应符合中国植物检疫的有关规定,除非审批机关允许或要求进行处理,提交的繁殖材料一般不进行任何影响品种性状正常表达的处理,如果已处理,应提供处理的详细说明。

2.4 制定测试方法

测试方法是对测试周期、测试地点、田间试验、性状观察、附加测试等进行具体要求。已公布的13个药食用菌DUS测试指南的指定的测试方法见表3。药食用菌的测试周期至少为2个独立的生长周期,即从发菌到第1潮子实体菌盖完全打开、展平。通常在1个地点进行测试,如果某些性状在该地点不能充分表达,可在其他符合条件的地点对其进行观测。田间试验的每小区栽培数依据品种不同而不同,但都进行2个重复,在此之前,田间测试实验设计的要素是要在能保证菌种正常生长、性状正常表达以及有利于观测的条件下进行。最后,在进行个体观测性状时可对菌丝体、子实体或栽培种取样;进行群体观测性状时必须选取整个小区或规定大小的混合样本进行观测;而在观测个体或某部位时,每个个体只需取1个样本进行观测。

2.5 制定特异性、一致性和稳定性结果的判定

特异性、一致性和稳定性结果的判定是对总体原则以及3种特性的判定依据和方法进行定义(表4)。当申请品种至少在1个性状上与近似品种具有明显且可重现的差异时,即可判定申请品种具备特异性。如果1个品种具备一致性,则可认为该品种具备稳定性,一般不对稳定性进行测试;必要时,可以使用继代培养物进行栽培,与以前提供的繁殖材料相比,若性状表达无明显变化,则可判定该品种具备稳定性。测试品种一致性判定时,采用不同的群体标准和至少95%的接受概率,以及样本大小不同时,最多可允许的不同数量异型株表示。

表2 药食用菌DUS测试待测品种繁殖材料的要求

Table 2 Requirements for propagation materials of medicinal and edible fungi to be tested in DUS test

品种名提交形式提交数量/支培养温度/℃菌龄/d 白灵侧耳菌种≥325±1*10~14 羊肚菌属母种≥320±1* 7~10 香菇菌种≥32510~14 黑木耳菌种≥32510~14 灵芝菌种≥325±1*10~14 双孢蘑菇菌种≥325±110~14 金针菇母种≥321±1* 7~10 蛹虫草菌种≥32510~14 长根菇母种≥325±1*— 猴头菌母种≥325±110~14 蝉花母种≥325±110~14 真姬菇菌种≥32510~14 糙皮侧耳菌种≥325±1*—

“*”表示性状表注释中的菌丝培养温度 “—”表示DUS测试指南中无明确菌龄要求

“*” indicates the culture temperature of mycelium in the notes of character table “—” indicates that there is no clear requirement for bacterial age in DUS test guideline

表3 药食用菌DUS测试方法的要求

Table 3 Requirements of DUS test method for medicinal and edible fungi

名称测试周期/个测试地点/个田间试验测试数量 小区栽培数重复数群体个体/个部位/个 白灵侧耳21≥300袋2整个小区或规定大小的混合样本植株≥80— 羊肚菌21≥50袋2同上菌丝体≥5个平板,栽培种≥20,子实体≥401 香菇21≥60袋2同上子实体为601 黑木耳21≥60根菌棒2同上子实体为601 灵芝21≥50袋2同上个体≥401 双孢蘑菇21≥3瓶菌种2同上个体为1201 金针菇21100瓶2同上菌丝体≥4个平板,子实体≥601 蛹虫草21≥100瓶2同上菌丝体≥4个平板,子实体≥601 长根菇21≥30袋3同上菌丝体≥3个平板,子实体≥60,每个重复取20个1 猴头菌21≥100袋2同上菌丝体≥4个平板,子实体≥601 蝉花21≥100瓶2同上子实体≥601 真姬菇2160瓶2同上个体≥301 糙皮侧耳21≥100袋2同上菌丝体≥5个平板,子实体≥601

“—”表示无特定数量

“—” indicates that there is no specific quantity

2.6 制定性状表

性状表是对性状表的内容进行详细说明、举例和注释,性状表详细列出了性状名称、表达类型、表达状态及相应的代码和标准品种、观测时期和方法等内容,见表5。据统计可知,每个品种测试指南制定时性状选取的数量在18~32个,性状表达也不一致,除白灵侧耳的质量性状表达数量为0以外,其他性状表达数量均在1个以上;测试过程中至少选取4个时期、2种以上单种或2种测试方法联用的方法进行性状观察;进行测试的标准品种不低于3种。

表4 特异性、一致性和稳定性结果的判定

Table 4 Determination of specificity, consistency and stability of medicinal and edible fungi

名称特异性的判别稳定性的判别一致性的判别 群体标准/%接受概率/%允许异型体/个 白灵侧耳至少1个性状继代培养物栽培,性状无明显变化1≥95样本42~69:≤3;样本70~99:≤4 羊肚菌至少1个性状继代培养物栽培,性状无明显变化8≥95样本5:≤0;样本20:≤1;样本36~82:≤2 香菇至少1个性状继代培养物栽培,性状无明显变化1≥95样本60:≤2 黑木耳至少1个性状继代培养物栽培,性状无明显变化1≥95样本60:≤2 灵芝至少1个性状继代培养物栽培,性状无明显变化2≥95样本42~69:≤3;样本70~99:≤4 双孢蘑菇至少1个性状继代培养物栽培,性状无明显变化1≥95样本120:≤3 金针菇至少1个性状继代培养物栽培,性状无明显变化1≥95样本60:≤2 蛹虫草至少1个性状继代培养物栽培,性状无明显变化1≥95样本60:≤2 长根菇至少1个性状继代培养物栽培,性状无明显变化2≥95样本100~131:≤5 猴头菌至少1个性状继代培养物栽培,性状无明显变化8≥95样本60:≤8 蝉花至少1个性状继代培养物栽培,性状无明显变化2≥95样本60:≤2 真姬菇至少1个性状继代培养物栽培,性状无明显变化1≥95样本30~35:≤1;样本36~60:≤2 糙皮侧耳至少1个性状继代培养物栽培,性状无明显变化2≥95样本100:≤5

表5 药食用菌DUS测试指南性状数量统计

Table 5 Quantitative statistics of DUS test guide for medicinal and edible fungi

名称数量观测方法 总性状质量性状假质量性状数量性状观测时期标准品种 白灵侧耳280 8205 3VS、VG、MG、VS 羊肚菌属25214 96 3VG、VG/VS、MS 香菇357 919518MS、VG、VS、MG 黑木耳192 215612MS、VG 灵芝属323 8218 6MG、MS、VG 双孢蘑菇231 517810VG、VG/MS、MG 金针菇212 217623VG、MS、MG、MS/VG 蛹虫草214 215713MS、VG、MG 长根菇181 3144 6VG、MS、MG 猴头菌201 316514MS、VG、VG/MS 蝉花181 1167 8MS、VG、MG 真姬菇284 519513VG、MS 糙皮侧耳243 318523VG、MS/VG、MG、MS

MG-群体测量 MS-个体测量 VG-群体目测 VS-个体目测

MG-population measurement MS-individual measurement VG-group visual inspection Vs-individual visual inspection

3 展望与建议

3.1 增加受保护药食用菌新品种

药食用菌申请量以及授权品种量虽呈大幅增长的趋势,但就目前仅公布的13个DUS测试指南数和授权品种数目在总体受保护品种数目仅占6%,药食用菌新品种申请及授权主要集中在白灵侧耳、羊肚菌属、香菇、黑木耳和灵芝5个种属,其他已有DUS测试指南的药食用菌,如双孢蘑菇、金针菇和蛹虫草等8个种属虽已有新品种的申请但均未见获批,药食用菌新品种申请及授权呈现分布不均匀、新品种权保护的力度远小于其他种类的现象。建议组织开展药食用菌新品种DUS测试指南的制定,完善药食用菌新品种保护制度,调动育种者申请药食用菌新品种保护的积极性。

3.2 提升药食用菌DUS测试技术

药食用菌DUS测试测试性状多,工作量较大,测试性状多数为数量性状,受温度、时间等因素的影响较大,目前观测技术较为传统。建议提升药食用菌DUS测试技术,合理应用分子生物学前沿技术推动药食用菌优良新品种转化,如通过分子标记技术[31]和多基因关联分析[32]筛选和鉴定药食用菌优良品种。通过测试新技术、新方法的研究,稳定药食用菌DUS测试技术指标和参数,提高药食用菌新品种评价的科学性。

3.3 建立药食用菌专用DUS测试中心

我国现有的27个测试分中心其主要功能是研究相关植物的测试技术与标准、承担DUS测试技术鉴定工作和技术咨询服务[33]。现有DUS测试分中心大多为综合性测试机构或以粮食作物为重点的测试中心。截至目前,只有上海和公主岭2个测试分中心承担部分食用菌DUS测试,未有1个测试分中心是专用于药食用菌DUS测试。由于药食用菌在种质培育、种植生产过程中与植物作物存在显著差异,建议建立药食用菌专用DUS测试中心,更加专业化地开展药食用菌新品种测试服务。

3.4 加强药食用菌新品种保护的国际对接

伴随着知识经济成为时代潮流,新品种创新成为国际环境下中国种业的核心竞争力之一。药食用菌新品种权对外申请数量少、知识产权保护意识不足等问题突出[28],在药食用菌领域,目前我国缺少走出国门、走向国际的意识。为提升药食用菌新品种创新,建议加强国际对接;学习国际新品种培育与测试先进技术,在已被UPOV采用的茶、山茶、牡丹和丁香的国际指南基础上编制出药食用菌国际指南[34],强化DUS测试信息化模式,与各成员国交换共享品种名审查系统,DUS试验设计与数据分析软件及设备[35],与“一带一路”沿线国家建立持续有效的合作,促进药食用菌新品种保护国际化发展。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

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Development status and perspective of new varieties protection and DUS test guide for medicinal and edible fungi

LIU Xiao-liu1, 2, ZHONG Can1, 2, XIE Jing1, 2, HOU Feng-fei3, DAI Jia-mu4, ZHANG Shui-han1, 2, JIN Jian1, 2

1. Academy of Chinese Medicine, Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, China 2. Institute of Chinese Materia Medica, Hunan Academy of Chinese Medicine, Changsha 410013, China 3. Hunan Butian Pharmaceutical Co., Ltd., Changsha 410017, China 4. Hunan Fuling Engineering Technology Research Center, Changsha 410017, China

Medicinal and edible fungi are important biological groups with many biological functions. In recent years, more and more attention has been paid to research and utilization of medicinal and edible fungi in China. The industry and species of medicinal and edible fungi are rapidly diversified, and the problems of new variety protection and variety rights are becoming prominent. Thirteen DUS (distinctness, uniformity and stability) testing guidelines for fungi issued by Ministry of Agriculture and rural areas are introduced in this paper, and the scope, issuing time, main contents, submission requirements and test characteristics of DUS testing guidelines for fungi issued by the Ministry of Agriculture and rural areas are interpreted and analyzed. The development of DUS test guide for medicinal and edible fungi and research status of test technology are summarized. The development process and application for authorization of new varieties of edible fungi are discussed. Finally, suggestions on protection of new varieties of medicinal and edible fungi and development and existing problems of DUS testing technology are put forward.

medicinal and edible fungi; DNA molecular marker technology; specificity; consistency; stability; variety right

R282

A

0253 - 2670(2022)04 - 1173 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.04.026

2021-09-22

湖南省重点研发计划项目(2022NK2005);湖南创新型省份建设专项(2020SK2029、2020NK4197);长沙市杰出创新青年培养计划项目(kq2009084);2018年中医药公共卫生服务补助专项“全国中药资源普查”(财社[2018]43号)

刘晓柳(1995—),女,硕士,研究方向为分子生药学。E-mail: liu992482176@163.com

金 剑,副研究员,硕士生导师,研究方向为中药生物技术与中药资源综合开发利用。E-mail: jinjian2016@163.com

[责任编辑 崔艳丽]

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