细胞色素P450诱导剂对Gibberella intermedia CA3-1双羟化去氢表雄酮的影响

石维利，李 会，史劲松，许正宏

（1.江南大学 药学院，江苏 无锡214122；2.江南大学 生物工程学院 工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡2141222；3.江南大学 粮食发酵工艺与技术国家工程实验室，江苏 无锡214122）

甾体激素类药物是仅次于抗生素的第二大类药物，被广泛应用于抗炎、利尿、合成代谢、避孕、抗雄激素、孕激素和抗癌等方面［1－3］。3β，7α，15α-三羟基雄甾-5-烯-17-酮（7α，15α-diOH-DHEA）是合成新一代女用口服避孕药“优思明”的活性成分屈螺酮的关键中间体，可以通过微生物产生的羟化酶对去氢表雄酮（DHEA）的双羟化作用获得［4－5］。一 些 真 菌，如 中 间 型 赤 霉 菌（Gibberella intermedia）［6］、尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）［7］和亚麻刺盘孢（Colletotrichum lini）［8］可以将DHEA转化为7α，15α-diOH-DHEA。

生物体内行使甾体羟化功能的是细胞色素P450酶（CYP450）［7］，因此CYP450表达量的高低是影响甾体底物羟化效率的关键因素［9］。胡东莉等［10］和Carballeira等［11］研究发现，包括甾体化合物、苯巴比妥盐类和含氧化合物在内的多种有机化合物可作为CYP450的诱导剂，这些诱导剂大多数是CYP450的底物或底物类似物，如DHEA可以使Colletotrichum liniST -1中细胞色素P450的含量以及双羟产物7α，15α-diOH-DHEA的摩尔得率分别提高40%和26.9%［1］。其他诱导剂（如苯巴比妥、苯、己烷和乙醇等）对各种CYP450的诱导作用［12－14］也得到了广泛的研究。

本课题组在前期研究中筛选获得的一株丝状真菌G.intermediaCA3-1［6］能够双羟化DHEA生成7α，15α-diOH-DHEA，当DHEA质量浓度为8 g／L时，7α，15α-diOH-DHEA的摩尔得率为45.3%。为了进一步提高G.intermediaCA3-1对DHEA的双羟化效率，本研究考察不同诱导剂对G.intermediaCA3-1转化DHEA生成7α，15α-diOH-DHEA生物转化过程的影响，并筛选确定最适诱导剂的添加浓度和诱导时间。在以上工作基础上，在5 L发酵罐中比较添加苯的新工艺和不添加苯的传统工艺对G.intermediaCA3-1双羟化DHEA生成7α，15α-diOH -DHEA的影响，以期为7α，15α-diOHDHEA的工业化生产提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

Gibberella intermediaCA3-1，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC 4903）。

1.1.2 试剂

DHEA（纯度为99%）、7α，15α-diOH-DHEA（纯度为98.4%），浙江仙居君业药业有限公司；乙醇、丙酮、己烷、苯、巴比妥和其他常用化学品，上海国药化学试剂有限公司。

1.1.3 培养基

斜面培养基（用于活化）（g／L）：葡萄糖10、酵母粉7.5、NaCl 1.5、KH2PO42.5、琼脂20；pH 7.0～7.2。

种子培养基（g／L）：葡萄糖10、酵母粉7.5、NaCl 1.5、KH2PO42.5；pH7.0。

转化培养基（g／L）：葡萄糖15、酵母粉15、玉米浆2.0；pH 6.5。

1.2 方法

1.2.1 培养和转化方法

将保藏的G.intermediaCA3-1菌株进行活化培养后，将菌种接种至装有50 mL种子培养液的500 mL三角瓶中，在30℃、200 r／min的恒温摇床上培养。待菌体进入快速生长期（接种后24 h），将种子液以体积分数为10%的接种量接种至装有30 mL转化培养基的250 mL三角瓶中，在相同条件下进行转化培养。准确称取8 g／L的DHEA添加到已转化培养24 h的菌液中，在相同条件下继续转化72 h。

1.2.2 诱导剂对G.intermediaCA3-1生物转化的影响

G.intermediaCA3-1转化培养12 h后，分别将不同诱导剂（己烷、苯、丙酮、无水乙醇、DHEA和巴比妥）添加至培养基中进行诱导。其中，己烷、苯、丙酮和乙醇的添加体积分数为0.6%，DHEA和巴比妥的添加体积分数为0.2%，同时以不添加诱导剂时的生物转化过程作为对照。

1.2.3 分析方法

CYP450的含量用Guengerich等［15］研究的CO差异光谱法测定，具体计算见式（1）。

式中：ΔA450为通入CO后添加连二亚硫酸钠的样品在450 nm处的吸光度之差；ΔA490为只添加连二亚硫酸钠的样品在490 nm处的吸光度之差；ε450为CYP450酶的摩尔吸光系数（91 mmol／（L·cm））。分别比较添加最佳诱导剂和对照组的CYP450含量。

采用干质量法测定菌体生物量。将发酵液以12 000 r／min的转速离心10 min，然后收集沉淀的菌丝体用蒸馏水洗涤2次，将洗涤过的菌丝体样品在80℃下干燥至恒质量。

采用高效液相色谱法（HPLC）分析转化产物。测试条件：色谱柱为Agilent C18柱；流动相V（乙腈）∶V（水）＝70∶30；流速为0.5 mL／min；进样量为10 μL；柱温为30℃；检测波长为206 nm。产物7α，15α-diOH-DHEA摩尔得率的计算见式（2）。

式中：ρP为产物7α，15αdiOHDHEA的质量浓度（g／L）；ρS为投加底物质量浓度（8 g／L）；MS为底物DHEA的 摩 尔 质 量（288 g／mol）；MP为 产 物7α，15α-diOH-DHEA的摩尔质量（320 g／mol）。

1.2.4 统计学分析

本研究中的数据均采用SPSS软件进行分析，利用ANOVA来验证统计分析结果，用平均值±标准差的方式（mean±SD）来显示统计结果的处理，当结果中的P＜0.05时，表示数据具有统计学意义。

2 结果与讨论

2.1 不同诱导剂对G.intermedia CA3-1生物转化DHEA的影响

DHEA的羟化与微生物体内的CYP450有关，而CYP450可以通过DHEA、己烷、巴比妥等化合物进行诱导［1，12－14］。因此，考察6种已被证实可作为CYP450诱导剂的有机化合物（己烷、苯、丙酮、乙醇、DHEA和巴比妥）对G.intermediaCA3-1生物转化DHEA的影响，结果如表1所示。

表1 不同诱导剂对G.intermedia CA3-1生物转化DHEA的影响Table 1 Effects of different inducers on the DHEA bioconversion by G.intermedia CA3-1

由表1可知：与对照组相比，在添加水溶性诱导剂丙酮、乙醇和巴比妥后，7α，15α-diOH-DHEA的摩尔得率降低；而在添加脂溶性诱导剂己烷、苯和DHEA后，7α，15α-diOH-DHEA的摩尔得率与对照组相比分别提高了8.5%、17.8%和14.2%。其中，在苯的诱导下，7α，15α-diOH-DHEA的最高摩尔产率达到54.0%±1.43%，因此选择苯作为最佳诱导剂。

2.2 苯的添加量对G.intermedia CA3-1生物转化DHEA的影响

诱导剂的添加量对细胞的生长及产品的产量是至关重要的，如果诱导的用量过低起不到诱导作用，若用量过高则会抑制菌体的生长和代谢。因此，考察不同体积分数的苯对菌株生物量和7α，15α-diOH-DHEA摩尔得率的影响，结果见图1。图1可知：当苯的体积分数＞1.0%时，细胞的生长受到显著抑制，导致产物7α，15α-diOH-DHEA的摩尔得率较低；当苯的体积分数为0.2%～0.8%时，苯对细胞几乎没有毒性，特别是当苯的体积分数为0.8%时，7α，15α-diOH-DHEA的摩尔得率达到最高（57%±1.24%），比对照组提高了24%。因此，确定苯的最佳添加体积分数为0.8%。

图1 苯体积分数对G.intermedia CA3-1生物转化DHEA的影响。Fig.1 Effects of benzene concentrations on the DHEA bioconversion by G.intermedia CA3-1

2.3 苯的添加时间对G.intermedia CA3-1生物转化DHEA的影响

由于酶的活性随细胞的生长期变化而变化，所以诱导剂的添加时间通常在对数生长期［16］。本研究前期对G.intermediaCA3-1的生长曲线进行测定，结果发现，G.intermediaCA3-1接种后0～12 h为菌体生长的延滞期，16～28 h为对数生长期，28 h进入稳定期。在此基础上，为了确定苯诱导CYP450转化生成7α，15α-diOH-DHEA的最佳添加时间，在G.intermedia生长不同时期（接种后0、4、8、12、16和20 h）添加体积分数0.8%苯进行诱导，在对数生长结束时（转化24 h）添加8 g／L DHEA进行转化，结果如图2所示。

由图2可知：当苯的添加时间为接种后12 h时，7α，15α-diOH-DHEA的摩尔得率达到最高（59%±0.97%），这可能是这时菌体开始进入对数生长期，生长速度快，因此诱导效果较好；当苯的添加时间晚于12 h时，7α，15α-diOH-DHEA的摩尔得率明显下降。因此，对于苯诱导生物转化过程的最适条件：在接种后第12小时后添加0.8%苯，对数生长期结束时（转化24 h）添加8 g／L DHEA进行转化。

图2 苯的添加时间对G.intermedia CA3-1生物转化DHEA的影响Fig.2 Effect of the time point of addition of benzene on the DHEA bioconversion by G.intermedia CA3-1

2.4 5 L发酵罐中苯诱导生物转化过程

在5 L发酵罐中进一步研究苯诱导G.intermediaCA3-1的生物转化过程，结果如图3所示。

图3 苯诱导G.intermedia CA3-1生物转化DHEA的时间曲线Fig.3 Time curves of benzene induction process from DHEA by G.intermedia CA3-1

由图3可知：在苯诱导的生物转化过程中，G.intermediaCA3-1的双羟化效率显著提高，7α，15α-diOH-DHEA的摩尔得率在88 h时达到最高（68.7%±1.37%），比对照组提高了29.6%。此外，转化周期比对照组的（96 h）缩短了8 h。

2.5 苯的诱导对CYP450表达的影响

虽然Gut等［17］研究发现，苯对动物细胞的CYP450有诱导作用，但苯对微生物的CYP450诱导作用的研究较少，因此考察苯对丝状真菌CYP450的诱导作用。为了确认苯是否会影响G.intermediaCA3-1中CYP450的浓度，所以分别测定对照组以及苯诱导过程中CYP450的浓度，结果见图4。

由图4可知：在苯诱导的生物转化过程中，CYP450的含量显著提高，并且在80 h时达到最高（263 pmol／L），比对照组的提高了43%。研究证实，苯对CYP450的诱导表现为自诱导作用，即苯为所诱导产物CYP450的底物［18］。因此推测，苯可作为CYP450的底物诱导CYP450的表达进而提高CYP450的浓度。

图4 苯诱导生物转化过程对CYP450浓度的影响Fig.4 Effects of the benzene induction biotransformation process on the concentration of CYP450

3 结论

将苯作为丝状真菌G.intermediaCA3-1中CYP450的诱导剂并研究其对G.intermediaCA3-1双羟化DHEA的影响。通过单因素试验确定基于苯诱导的新型生物转化工艺的最适条件：接种量为10%（体积分数）、苯的添加体积分数为0.8%、苯的添加时间为接种后12 h、底物的添加时间为转化24 h后，此时产物摩尔得率达到最高的59%±0.97%。基于以上工作基础，在5 L发酵罐上进行放大研究，结果发现，在苯诱导下，CYP450的浓度比对照组的提高43%，7α，15α-diOH-DHEA的摩尔得率提高到68.7%±1.37%，同时转化期缩短8 h。本研究为工业化生产7α，15α-diOH-DHEA奠定了良好的基础。然而，对于苯诱导CYP450表达的具体机制还有待进一步明确，这将是我们今后研究的方向。