一测多评法同时测定侧柏叶中5种黄酮类成分的含量

刘星蕾，里艳茹，许函铢，李 映，寻 园，王 丹，周 骅，谢百波*

(1.北京慧宝源生物技术股份有限公司，北京102206；2.北京城市学院，北京100094)

侧柏叶是临床常用中药之一，又名柏叶、扁柏、云片桕、丛柏叶等，是柏科植物侧柏Platycladusorientalis(L.)Franco的干燥枝梢和叶[1]，全国大部分地区均有分布。侧柏叶为补阴要药[2-3]，具有凉血止血、化痰止咳、消肿散毒、祛风降湿、乌发生发等功效，临床主要用于衄血、崩漏下血、吐血、略血、便血、血热脱发、肺热咳嗽、须发早白等。

侧柏叶的化学成分复杂[4-8]，主要含有黄酮类、挥发油、鞣质、萜类、无机元素等，具有抑菌、止血凝血、促进血液循环、镇咳祛痰、抗肿瘤和抗红细胞氧化、抑制络氨酸酶、抗炎、降血脂、镇静、神经保护、抑制肠道细菌生长、乌发生发等多种药理作用，其主要药用有效成分是黄酮类和挥发油类。在侧柏叶的多种黄酮类成分中，槲皮苷的含量最高，对于槲皮苷、芦丁和穗花杉双黄酮等成分的含量测定，也是侧柏叶黄酮提取工艺和质量标准较为常用的测定指标[9-11]。

目前，关于黄酮类及挥发油成分提取、分离和含量测定的研究报道相对较多[7]，研究也相对充分，可以为中药侧柏叶中化学成分的一测多评研究提供一定参考。王娟弟等[12]采用高效液相色谱法同时测定了中药侧柏中杨梅苷、异槲皮苷、槲皮苷和穗花双黄酮4种化学成分的含量；石典花等[13]以槲皮素为内标物，通过建立异槲皮苷、槲皮苷、山柰酚、穗花双黄酮、扁柏双黄酮的一测多评法，完善了侧柏炭质量控制标准；丁航等[9]采用高效液相色谱法和紫外可见分光光度法两种方法对侧柏叶的黄酮含量进行了比较；孟丽娟等[6]建立了4种成分包括杨梅苷、槲皮苷、穗花杉双黄酮和扁柏双黄酮的含量测定方法；宗珊珊等[14]测定了10批侧柏叶药材中杨梅苷、异槲皮苷、槲皮苷、穗花双黄酮4种成分的含量，并建立了侧柏叶的HPLC指纹图谱。通过综合分析已有研究成果，目前尚缺乏关于侧柏叶一测多评的相关研究。因此，对中药侧柏叶中几种含量较高的代表性成分进行一测多评研究，对侧柏叶资源的开发和利用具有重要意义。

本研究拟采用高效液相色谱法建立侧柏叶中5种黄酮类成分的一测多评方法。一测多评法(QAMS)以单味药材或中成药中的某一指标成分作为内参物，建立内参物与其他待测成分之间的相对校正因子(RCF值)[15]，根据相对校正因子推算出该中药几种其他成分的含量，既能进行多成分的质量控制，又能解决对照品短缺和检测成本过高的问题，是对中药进行含量测定和质量控制的热点和方向，目前该方法已广泛应用于中药的质量控制[16]。

槲皮苷具有含量高、价格低廉、提取方法简单、分析结果准确性高、应用广泛等优点，故本研究选择槲皮苷为内参物，测定5种成分间的相对校正因子，建立侧柏叶中槲皮苷、杨梅苷、阿福豆苷、穗花杉双黄酮、扁柏双黄酮等5种成分的一测多评分析方法。同时用外标法测定5种成分的含量，与QAMS法测定的含量进行比较，以考察方法的准确度。

1 仪器与试剂

1.1 实验材料

侧柏叶原药材9批(见表1)，经北京大学药学院生药学教研室李耀利博士鉴定为柏科植物侧柏Platycladusorientalis(L.)Franco的干燥枝梢和叶；试剂：甲醇、磷酸、乙腈、超纯水，其中乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

表1 侧柏叶药材来源

对照品：杨梅苷(批号：PRF20051204)；槲皮苷(批号：PRF10010921)；阿福豆苷(批号：PRF10-122601)；穗花杉双黄酮(批号：PRF20052701)；扁柏双黄酮(批号：DST200522-099)。均购自成都普瑞法科技开发有限公司，纯度均≥98.00%。

1.2 实验仪器

Agilent 1260 Infinity高效液相色谱仪(Agilent Technologies)；Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；SPD-M20A高效液相色谱仪(岛津企业管理有限公司)；电子天平(PL203，梅特勒-托利多仪器有限公司)；高速多功能粉碎机(BJ-150，拜杰有限公司)；旋转蒸发器(RE52AA，上海亚荣生化仪器厂)；超声波清洗机(SB2512，宁波新芝生物科技股份有限公司)。

2 方法与结果

2.1 方法

2.1.1 系统适用性及专属性试验色谱条件 色谱柱：Eclipse Plus-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：乙腈(A)-0.1%磷酸(B)，梯度洗脱(0～30 min，10%～20% A；30～50 min，20%～40% A；50～90 min，40%～70% A；90～110 min，70%～100%A)；柱温：30 ℃；流速：1 mL/min；检测波长：355 nm；进样量：10 μL。

系统适应性试验：按HPLC色谱条件精密吸取混合对照品溶液和供试品溶液各10 μL进样，观察峰形和对应的保留时间。专属性试验：取空白溶剂阴性对照溶液，滤过，取续滤液10 μL，注入色谱仪，观察空白溶剂对测定是否有干扰。结果显示，混合对照品溶液与供试品溶液在相同保留时间有相应峰形，峰形对称，无拖尾现象(见图1)。根据测定后供试品溶液与混合对照品溶液的色谱图所示，出峰顺序依次为杨梅苷、槲皮苷、阿福豆苷、穗花杉双黄酮、扁柏双黄酮。5种成分的分离度均>1.5，且与邻近的杂质分离度均>1.5。空白溶剂阴性对照溶液在测定峰位置无峰，表明空白溶剂对侧柏叶的各组分含量测定无干扰。

注：A：空白溶剂阴性对照溶液；B：混合对照品溶液；C：侧柏叶供试品溶液。1.杨梅苷；2.槲皮苷；3.阿福豆苷；4.穗花杉双黄酮；5.扁柏双黄酮。

2.1.2 供试品溶液的制备 精密称取侧柏叶药材粗粉1.000 g，置于50 mL具塞锥形瓶中，加甲醇25 mL，称定质量，超声处理30 min，放冷，甲醇补足失重，摇匀，抽滤，取续滤液，减压蒸干，加适量甲醇溶解，滤液置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度线，经0.45 μm微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。

2.1.3 对照品溶液的制备 精密称取杨梅苷、槲皮苷、阿福豆苷、穗花杉双黄酮、扁柏双黄酮对照品适量，加甲醇制成质量浓度分别为0.619、0.958、0.557、0.597、0.133 mg/mL的各对照品溶液。

2.2 方法学考察

2.2.1 标准曲线绘制 精密吸取“2.1.3”项下各对照品溶液，逐级稀释制成6个适宜浓度的对照品溶液，注入高效液相色谱仪，进样浓度分别为：杨梅苷0.020、0.040、0.080、0.160、0.320、0.400 mg/mL，槲皮苷0.050、0.100、0.200、0.400、0.800、0.958 mg/mL，阿福豆苷0.005、0.010、0.020、0.040、0.080、0.100 mg/mL，穗花杉双黄酮0.010、0.020、0.040、0.080、0.160、0.200 mg/mL，扁柏双黄酮0.005、0.010、0.020、0.040、0.080、0.120 mg/mL，进样体积均为10 μL，测定峰面积，以峰面积(Y)为纵坐标，对照品浓度(X)为横坐标绘制标准曲线，计算线性回归方程，考察结果见表2。

表2 5种黄酮类成分的线性关系和范围

2.2.2 仪器精密度试验 取“2.1.2”项下同一供试品溶液，按照上述的色谱条件重复进样6次，测定并记录峰面积，测定杨梅苷、槲皮苷、阿福豆苷、穗花杉双黄酮、扁柏双黄酮5种成分的RSD值分别为0.130%、0.057%、0.064%、0.060%和0.192%，表明仪器精密度良好，符合测定要求。

2.2.3 日间精密度试验 取“2.1.2”项下供试品溶液，由1名实验人员，分别在3天内，样品每天按照上述色谱条件重复测定2次，记录色谱图，测定峰面积，计算侧柏叶供试品溶液中杨梅苷、槲皮苷、阿福豆苷、穗花杉双黄酮、扁柏双黄酮5种成分的RSD值分别为0.735%、0.581%、0.569%、0.928%和1.028%，表明此方法日间精密度良好。

2.2.4 重复性考察 取同批购买自安国市场的侧柏叶样品6份，按照“2.1.2”项下方法制备成侧柏叶供试品溶液，按“2.1.1”项下的HPLC色谱条件进样分析，记录峰面积，测得杨梅苷、槲皮苷、阿福豆苷、穗花杉双黄酮、扁柏双黄酮每种成分平均含量分别为0.134%、0.282%、0.031%、0.040%、0.050%，其RSD值分别为2.110%、2.352%、2.352%、2.355%、2.339%，RSD值均≤3%，表明该方法重复性良好。

2.2.5 稳定性试验 取同一样品溶液，按照“2.1.1”项下色谱条件，分别在不同时间点，即0、2、4、8、12、24 h精密量取样品10 μL，注入液相色谱仪，测定峰面积，计算杨梅苷、槲皮苷、阿福豆苷、穗花杉双黄酮、扁柏双黄酮5种黄酮类成分的峰面积RSD值分别为1.145%、1.124%、1.431%、0.987%、0.987%，RSD值均≤2%，表明供试品在24 h内稳定性符合要求。

2.2.6 加样回收率试验 取已知含量样品6份，精密称定，按“2.1.2”项下供试品溶液制备方法提取并蒸干，用甲醇溶解，按样品量的80%、100%、120%加入每种对照品储备液，混匀，定容至10 mL，0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，分别精密量取10 μL，注入液相色谱仪，按“2.1.1”项下HPLC色谱条件进行测定，计算回收率和RSD值。测得杨梅苷、槲皮苷、阿福豆苷、穗花杉双黄酮、扁柏双黄酮5种黄酮类成分平均回收率分别为102.395%、101.111%、101.309%、99.331%、101.113%，RSD值分别为1.312%、1.120%、1.434%、0.855%、1.551%，RSD值均≤2%，表明该方法具有良好的回收率。

2.3 相对校正因子(RCF)考察

2.3.1 相对校正因子的计算 利用对照品溶液和确定的分析条件建立内参物与待测成分之间的RCF。

校正因子计算公式为：fk/s=(Cs*Ak)/(Ck*As)

Cs为参照物质量浓度，As为参照物色谱峰峰面积，Ck为其他对照组分质量浓度，Ak为其他对照组分色谱峰峰面积[15]。

待测组分相对校正因子的计算：取“2.1.3”项下混合对照品溶液，分别按照“2.1.1”项下的HPLC色谱条件进样10 μL，进样6次，选择槲皮苷为内参物，分别计算杨梅苷、阿福豆苷、穗花杉双黄酮、扁柏双黄酮4种成分的相对校正因子。测得4种成分的相对校正因子分别为0.938、1.119、0.553、0.663，RSD分别是0.076%、0.061%、0.044%、0.043%。

2.3.2 相对校正因子重现性考察 分别考察安捷伦1260 Infinity、岛津SPD-M20A高效液相色谱仪2个品牌的高效液相色谱仪测定相对校正因子。分析发现，采用安捷伦1260 Infinity测定杨梅苷、阿福豆苷、穗花杉双黄酮、扁柏双黄酮的相对校正因子分别为0.938、1.119、0.553、0.663，RSD分别为0.076%、0.061%、0.044%、0.043%；采用岛津SPD-M20A测定相对校正因子分别为0.940、1.117、0.553、0.662，RSD值分别为0.097%、0.046%、0.081%、0.054%，通过2个不同品牌的高效液相色谱仪测得各成分相对校正因子的RSD(n=6)均<3%，结果表明，不同的高效液相色谱仪对相对校正因子影响较小。

2.4 一测多评法与外标法结果比较

分别精密称取9批不同产地的侧柏叶药材粉末1.000 g，按照“2.1.2”项下的方法制备，每批样品平行制备6份，记录各成分色谱峰峰面积，分别采用常规的外标法和一测多评法计算各成分的含量，计算RSD值，比较两种方法所得结果，计算相对误差(RE)，见表3。根据一测多评法(QAMS)与外标法(ESM)两种测定方法所得9批不同产地侧柏叶含量测定结果显示，2种方法测定的结果无统计学差异，表明该实验建立的一测多评法可用于侧柏叶中5种黄酮类化学成分的含量测定。

表3 一测多评法和外标法测定5种成分的含量 (mg/g)

3 讨论

一测多评法既能进行多成分的质量控制，又能解决对照品紧缺和检测成本过高的问题，可作为中药饮片、配方颗粒、中成药等中药制剂质量控制的有效手段，是中药进行含量测定和质量控制的热点方法和发展方向[16]。本研究首次将一测多评法用于侧柏叶药材的黄酮类化学成分含量测定，各项方法学考察结果均显示实验方法符合定量分析要求。

一测多评法用于多成分的质量控制，可同时解决对照品紧缺和检测成本过高的问题，具有低成本的优势。因此，在内参物的选择上，本研究选择经济易得、来源充足、含量较高且化学性质稳定的槲皮苷作为内参物。

通过统计学方法对一测多评法与传统的外标法测定出的侧柏叶中5种有效成分含量进行比较，结果显示，两者测定出的含量值没有显著性差异，准确度良好。应用一测多评法测定侧柏叶中黄酮类成分的含量，可有效应对大量分离纯化难度较高的化学对照品稀缺以及价格昂贵的局面，为侧柏叶药材以及相关制剂质量标准的研究提供了有力的理论依据和数据支撑。

4 结语

本实验建立的一测多评法，准确、简单，填补了一测多评法测定中药侧柏叶黄酮类成分的研究空白。通过高效液相色谱法建立侧柏叶中5种黄酮类成分的一测多评方法，实现了仅用槲皮苷1个对照品即可同时检测侧柏叶中5种黄酮化合物的含量，既进行了多成分的质量控制，又解决了对照品紧缺和检测成本过高的问题，可为提高侧柏叶质量标准提供依据，为侧柏叶的综合利用与开发提供技术参考。