牛多杀巴氏杆菌的生物学特性研究

傅伟文

（合浦县畜牧技术推广中心 536199）

多杀巴氏杆菌是一种革兰氏阴性菌，能感染家禽、猪、牛、羊等多种动物，其中，牛、羊感染多杀巴氏杆菌通常表现为出血性败血症，家禽感染可引起禽霍乱，猪感染可引起猪肺疫，成为危害畜牧行业的病原之一[1]。本研究以广西某养殖场出现呼吸道症状的病牛为研究对象，采集肺脏组织，采用细菌的分离培养、多杀性巴氏杆菌特异性基因kmt扩增、血清型扩增鉴定、毒力基因（转铁蛋白tbpA、编码4型菌毛基因ptfA、血红色获得受体hasR、脂蛋白plpE、外膜蛋白ompH）的扩增、药敏试验、致病性试验等方法对细菌特性进行研究，旨在了解该牛呼吸道病例病原种类的确定及病原的致病机理，为该病的防控、疫苗的研制奠定基础。

1 材料

1.1 病料样品

2021年7月，病料来源于广西某养牛场送检的肺脏组织。据主诉，该病例临床症状表现为咳嗽、流鼻涕；剖检发现肺出血、水肿；肠道黏膜充血等症状。

1.2 试验动物

6～8周龄、体重为22g左右的健康昆明鼠10只，购自广西中医药大学。

1.3 试剂及仪器

PCR仪、凝胶成像系统，购自Bio-rad公司；细菌DNA提取试剂盒、2×Taq MasterMix等，均购自北京康为世纪生物技术有限公司；药敏纸片，购自杭州滨和微生物试剂有限公司。

1.4 引物合成

特异性基因kmt引物、5种荚膜血清型引物（A/B/D/E/F型）、5种毒力相关基因（tbpA、ptfA、hasR、plpE、ompH）引物参照吴翠兰、马晓菁、何传雨等文献[2-4]的引物序列，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

2 方法

2.1 细菌分离与培养

无菌采取病料组织划线接种于血平板琼脂培养基上，37℃培养24～48h观察，记录情况。挑取单个菌落进行革兰氏染色，镜检。

2.2 分离菌PCR扩增

用细菌基因组DNA试剂盒提取分离株基因组DNA，以该DNA为模板，用多杀巴氏杆菌特异性基因kmt引物、5种荚膜血清型引物（A/B/D/E/F型）、5种毒力相关基因（tbpA、ptfA、hasR、plpE、ompH）进行PCR扩增鉴定。扩增程序为：95℃预变性5min；然后进行30个循环95℃变性1min、50℃～60℃退火1min、72℃延伸1min 30s；最后再进行72℃延伸10min。扩增结束后，取7μL的PCR产物在1.5%的凝胶琼脂糖上进行电泳，观察电泳结果。

2.3 分离株的药敏试验

选取多粘菌素、头孢拉定、新霉素、四环素、氧氟沙星、环丙沙星、氟苯尼考、头孢曲松、强力霉素、庆大霉素、阿奇霉素、头孢氨苄、头孢噻肟、青霉素等14种药物进行测定分离株的耐药情况。

2.4 分离株的致病性试验

在无菌的操作下，5只试验组小鼠按剂量为0.2mL/只腹腔注射纯培养菌，另5只对照组则按剂量为0.2mL/只腹腔注射生理盐水。观察记录小鼠的精神状态和死亡时间等。

3 结果

3.1 细菌分离与培养结果

将肺病料接种于血琼脂平板置于37℃培养24～48h后，平板上生长有露珠样、透明、不溶血中等大小的菌落，挑取单个菌落革兰氏染色镜检可观察到革兰氏阴性短杆菌。

3.2 分离菌PCR扩增

将多杀巴氏杆菌特异性基因kmt引物进行PCR扩增、电泳后，结果显示，可扩出目的条带大小为456 bp的基因片段（图1），说明该分离株为多杀巴氏杆菌。

用5种荚膜血清型引物（A/B/D/E/F型）进行PCR扩增鉴定荚膜血清型，结果显示，只有A型能扩增出条带大小为1048 bp片段（图1）。

用5种毒力相关基因（tbpA、ptfA、hasR、plpE、ompH）进行PCR扩增鉴定，结果显示只有ptfA、plpE、ompH毒力基因扩增出与之相符的目的条带，目的条带大小分别为488 bp、1000 bp、438 bp（图1）。对目的条带进行切胶、回收、连接、转化、测序，测序结果经BLAST验证，该分离株含有ptfA、plpE、ompH这3个毒力基因。

图1 PCR结果

3.3 分离株的药敏试验结果

药敏结果检测显示，该分离株对头孢噻肟、头孢曲松、氧氟沙星、环丙沙星等敏感，对头孢氨苄、头孢拉定、强力霉素、庆大霉素等中敏；对多粘菌素、新霉素、四环素、氟苯尼考、阿奇霉素、青霉素耐药，见表1。

表1 药敏试验结果

3.4 分离株的致病性试验

试验组小鼠在接种后3h开始出现精神沉郁、运动减少；接种6h后小鼠运动迟钝；接种24h内小鼠全部死亡。剖开发现肺脏、脾脏肿大、出血，并从中分离到革兰氏阴性菌，经PCR验证，该菌与所注射的菌一致。而对照小鼠连续观察5d，未发现异常。结果表明，该分离株具有很强的致病性。

4 讨论

多杀巴氏杆菌是一种条件性致病菌，广泛存在于动物上呼吸道黏膜，当动物机体抵抗力水平下降，易导致病原体的侵入，进而使动物致病。根据荚膜血清型可将多杀巴氏杆菌分为5个血清型，即A、B、D、E、F型，不同的荚膜血清型引发的临床症状有所不同[5]。经过PCR验证，本次研究从牛肺中分离出1株A型多杀巴氏杆菌，符合国内多地报道的牛源多杀巴氏杆菌流行血清型[6-9]。

药物敏感性试验结果显示，该A型多杀巴氏杆菌分离株对头孢噻肟、头孢曲松、氧氟沙星、环丙沙星等敏感，对头孢氨苄、头孢拉定、强力霉素、庆大霉素等中敏；对多粘菌素、新霉素、四环素、氟苯尼考、阿奇霉素、青霉素耐药。结果表明，该分离株存在耐药性。吴同垒[10]对河北分离株进行药敏试验，结果显示，分离株对大多数药物敏感，但对复方新诺明、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶和林可霉素耐药较高，达到80%以上。杜英立等[6]对广西株进行药敏试验，结果显示，分离株对阿米卡星、卡那霉素、诺氟沙星敏感，对氟苯尼考、丁胺卡那、头孢曲松、庆大霉素、四环素中敏，对链霉素、红霉素、环丙沙星、青霉素耐药。由此可见，不同地区分离的菌株，细菌的耐药程度有所差异，因此，应在药敏试验结果的指导下合理用药，避免盲目用药。

本研究还对该分离株进行致病性试验，结果表明，该A型多杀巴氏杆菌广西分离株具有很强的致病性。多杀巴氏杆菌的毒力因子很多，例如黏附素相关因子在细菌黏附等方面具有非常重要的作用；荚膜多糖，具有抗吞噬、抗溶菌酶等作用；外膜蛋白在菌体对宿主感染和致病过程中起着非常重要的作用[4]。本研究对5种毒力基因tbpA、ptfA、hasR、plpE、ompH进行检测，结果显示ptfA、plpE、ompH这3个基因能检测出来，这些结果与马晓菁[3]、何传雨[4]等报道一致。Ewers等报道86.9%的多杀巴氏杆菌中隐含黏附有关的基因ptfA等[11]。ptfA菌毛是革兰氏阴性菌黏附宿主上皮组织细胞表面的重要毒力因子，具有黏附作用，其表达的蛋白质的免疫厡性已被证实，该基因的研究成为研究多杀巴氏杆菌的热点基因。plpE为多杀巴氏杆菌脂蛋白E，该蛋白具有高度的免疫厡性。ompH是多杀巴氏杆菌的外膜蛋白中的孔蛋白，作为研制疫苗的一种抗原蛋白[12]。目前我国预防的多杀巴氏杆菌苗主要是B型灭活疫苗，而目前国内频繁发生的主要是A型流行株，各血清型之间的交叉保护低，对多杀巴氏杆菌毒力因子研究为研制疫苗奠定基础。

参看文献

[1] 魏诗谣， 王丽扬， 张信军， 等.3株羊源D型多杀性巴氏杆菌的生物学特性研究[J].扬州大学学报(农业与生命科学版)， 2021， 42(4): 12-17.

[2] 吴翠兰， 刘琰， 李军， 等. D型多杀性巴氏杆菌和绵羊肺炎支原体引起山羊的混合感染[J].动物医学进展， 2020， 41(3):57-61.

[3] 马晓菁. 致犊牛肺炎多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及部分生物学特性研究[D].石河子:石河子大学， 2010.

[4] 何传雨. 牛源多杀性巴氏杆菌荚膜和毒力相关基因的克隆及序列分析[D].石河子:石河子大学， 2011.

[5] 王喜， 元正菊， 张信艳， 等.鸡源多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及生物学特性分析[J].中国兽医科学， 2021，51(11)：1411-1419..

[6] 杜英立， 吴翠兰， 陆震， 等.牛A型多杀巴氏杆菌的分离鉴定[J].今日畜牧兽医， 2021， 37(6): 5-6.

[7] 何泊宁， 周金玲， 赫鸣睿， 等.牛源A型多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及毒力基因检测[J].中国兽医科学， 2019， 49(8):1042-1047.

[8] 张贵刚， 徐丽媛， 黄海碧， 等.一株肉牛A型多杀性巴氏杆菌的分离与鉴定[J].中国动物传染病学报， 2019， 27(5): 86-90.

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[10] 吴同垒， 于秀建， 李巧玲， 等.肉牛多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及药敏分析[J].中国兽医学报， 2019， 39(9): 1728-1734.

[11] Ewers C ， Antina Lübke-Becker， Bethe A ， et al.. Virulence genotype of Pasteurella multocida strains isolated from different hosts with various disease status[J]. Vet Microbiol， 2006， 114(3-4):304-317.

[12] 蔡广强.多杀性巴氏杆菌毒力因子研究进展[J].上海畜牧兽医通讯， 2013(6): 7-9.