QuEChERS-高效液相色谱-串联质谱法测定水稻中氯虫苯甲酰胺和噻虫胺的残留

孙悦萍，周 芹，徐利剑，任红波，马文琼，张晓波，金海涛，陈国峰，刘 峰，董见南

（1黑龙江大学现代农业与生态环境学院，哈尔滨 150080；2黑龙江省农业科学院农产品质量安全研究所，哈尔滨 150086；3农业农村部甜菜品质监督检验测试中心，哈尔滨 150080；4农业农村部糖料产品质量安全风险评估实验室，哈尔滨 150080）

0 引言

氯虫苯甲酰胺，是一种具有广谱安全等优势的新型结构邻甲酰氨基苯甲酰胺类杀虫剂，对鳞翅目等害虫的防治效果显著，其作用于昆虫的机体功能，致使昆虫饥饿和死亡[1-2]。噻虫胺，是一种具有毒性低、长持效期、无交互抗性等优势的新烟碱类杀虫剂，有较好的内吸性、选择性和渗透性，其作用于昆虫的神经系统，致使昆虫麻痹和死亡[3-4]。水稻是中国主要的粮食作物，为提高产量和经济效益，减少病虫草害及环境污染等，合理选用低毒高效的农药成为选择之一，氯虫苯甲酰胺和噻虫胺的复配使用能够有效防治水稻上的二化螟和稻飞虱。

随着氯虫苯甲酰胺和噻虫胺的大面积使用，两者在作物中的残留及对环境的安全性备受关注。欧盟已规定氯虫苯甲酰胺在糙米中的农药残留最大限量(MRL)值为0.4mg/kg，国际食品法典委员会(CAC)规定在谷物中的MRL值为0.02mg/kg[5]，中国GB 2763—2021中规定稻谷中氯虫苯甲酰胺及噻虫胺MRL值均为0.5mg/kg[6]，其中前者为临时限量，但是还没有标准的检测方法。所以建立稻谷中氯虫苯甲酰胺和噻虫胺的测定方法迫在眉睫。

目前，氯虫苯甲酰胺和噻虫胺分析方法主要包括气相色谱法(GC-ECD)[7]、液相色谱法(HPLC)[8-9]及其液质联用法(LC-MS/MS)[10-11]和气质联用法(GC-MS/MS)等[12]。前处理净化方法主要有液液萃取[13]、固相萃取(SPE)[14]和基质固相分散萃取技术(QuEChERS)[15-16]方法。宋文芳利用高效液相色谱法研究辣椒中氯虫苯甲酰胺的残留量[9]，高效液相色谱具有普遍的选择性，但是其前处理过程较复杂，且灵敏度较低。冯柳娟利用气相色谱串联质谱(GC-MS/MS)研究大豆中氯虫苯甲酰胺的残留量[12]，但是此方法分析检测耗时过长，与高效液相色谱串联质谱比较前处理也过于复杂[8]。目前，对一些复杂基质的前处理，QuEChERS法应用较为广泛，而且净化效果也十分突出。选用QuEChERS法-超高效液相色谱-串联质谱法同时测定糙米、稻壳及秸秆中氯虫苯甲酰胺和噻虫胺的残留检测分析技术未见报道。拟建立的检测分析方法补充了这一领域的研究空白。本文优化了QuEChERS前处理方法中的提取溶剂及净化方法，考察了方法的线性关系、检出限、精密度及准确度，建立的方法满足农药残留分析要求，为在水稻上复配使用氯虫苯甲酰胺和噻虫胺提供相关可信的试验数据及依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

氯虫苯甲酰胺（纯度99%，上海市农药研究所）；噻虫胺（纯度98.2%，沈阳化工研究院）。乙腈、甲酸（色谱纯）；N-丙基乙二胺（PSA，40～60mesh，艾杰尔公司）；十八烷基键合硅胶（C18，50 μm，艾杰尔公司）；石墨化炭黑（GCB，120-400Mesh，艾杰尔公司）；有机系滤膜（尼龙，0.22μm，北京迪马欧泰科技发展中心）。其余试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

美国Waters Xevo TQ-S液相色谱/三重四级杆质谱联用仪；梅特勒电子天平；日本日立冷冻高速离心机；德国艾卡往复式振荡器。

1.3 试验方法

1.3.1 提取 称取样品（糙米10.0 g，稻壳2.0 g，秸秆2.0 g），依次加入20m L蒸馏水、20m L乙腈，混匀后振荡提取30m in，收集提取液，加入5 g氯化钠，涡旋3min，以5000 r/m in离心3m in，上清液待净化。

1.3.2 净化 分别吸取1m L糙米、稻壳和秸秆的上层待净化液，糙米待净化液中加入25mg C18，稻壳和秸秆待净化液中分别加入50 mg PSA，涡旋1 min，以10000 r/m in离心3m in，过0.22µm有机系滤膜，待液相色谱/质谱联用仪测定分析。

1.4 标准溶液的配制

分别称取适量氯虫苯甲酰胺和噻虫胺标准品，用乙腈配制成1000mg/L的标准储备液，再分别配制成100mg/L的标准溶液。将氯虫苯甲酰胺标准溶液用乙腈逐步稀释配制成0.1、1、10、20、100 μg/L系列标准工作溶液，将噻虫胺标准溶液用乙腈逐步稀释配制成0.1、1、10、100、200、500 μg/L系列标准工作溶液，临用现配。标准样品总离子流图（图1）。

图1 氯虫苯甲酰胺和噻虫胺标准样品总离子流图(0.1mg/L)

1.5 仪器条件

1.5.1 高效液相色谱条件 色谱柱：Waters Acquity UPLC® C18(50mm×2.1mm，1.7µm)；进样体积：2μL；流动相：乙腈（色谱），0.1%甲酸水溶液；梯度洗脱程序见表1。

表1 流动相及梯度洗脱条件

1.5.2 质谱分析条件 电喷雾正离子扫描(ESI+)，毛细管电压3.0 kV，离子源温度150℃，多反应离子监测模式，质谱参数见表2。

表2 氯虫苯甲酰胺和噻虫胺的质谱参数

1.6 检测限、定量限和添加回收率的测定

农药残留分析中的检测限是利用3倍的信噪比(S/N)来确定的，利用10倍的信噪比作为方法的定量限。为了确定氯虫苯甲酰胺和噻虫胺的检测限，分别将氯虫苯甲酰胺和噻虫胺的标准工作溶液(1.0m L)逐渐稀释，直到氯虫苯甲酰胺和噻虫胺的S/N比为3。

糙米、稻壳、秸秆中的氯虫苯甲酰胺和噻虫胺定量限的确定，将0.01mg/L氯虫苯甲酰胺和噻虫胺的工作溶液加标至糙米、稻壳和秸秆中，按照1.3中描述的方法进行提取、净化和分析，逐级稀释直至氯虫苯甲酰胺和噻虫胺的S/N比为10。

分别在空白糙米、稻壳和秸秆样品中添加3组浓度的氯虫苯甲酰胺和噻虫胺标准溶液，每组添加浓度重复5平行，按1.3试验方法处理各组回收样品，按1.5测定分析后，计算各组回收样品的平均回收率及其相对标准偏差。

1.7 数据处理

采用Excel软件进行数据处理分析。

2 结果与分析

2.1 提取溶剂的选择

在农药残留分析中，最常用的提取溶剂包括甲醇、乙腈、正己烷、乙酸乙酯等，根据目标物的性质选择合适的提取溶剂，利用“相似相溶”的原则，选择能够溶解目标化合物最大或者最合适的溶剂。一般情况下，对于极性较小的农药，可以选用正己烷、石油醚等，极性稍强的农药通常选择极性溶剂或者含水溶剂，如甲醇、乙腈等。

本实验中选择最常用的甲醇和乙腈作为提取溶剂，分别考察了两种溶剂的提取效果。使用氯虫苯甲酰胺和噻虫胺的标准溶液分别添加至空白的糙米、稻壳、秸秆样品中，使得上述3种基质中氯虫苯甲酰胺和噻虫胺的含量均为0.1mg/kg。如图2所示，使用甲醇对氯虫苯甲酰胺和噻虫胺的提取率在68.7%～88.4%之间，50%乙腈水的提取率在97.6%～99.7%之间，纯乙腈对氯虫苯甲酰胺和噻虫胺的提取率在86.4%～91.6%之间。因此，50%乙腈水是提取糙米、稻壳和秸秆中氯虫苯甲酰胺和噻虫胺的最佳溶剂。

图2 提取溶剂对氯虫苯甲酰胺和噻虫胺提取率的影响

2.2 净化方法的选择

在糙米(10.0 g)、稻壳(2.0 g)、秸秆样品(2.0 g)中加入氯虫苯甲酰胺和噻虫胺的标准溶液，使糙米、稻壳和秸秆空白样品中氯虫苯甲酰胺和噻虫胺的浓度均为0.1mg/kg，根据2.1中选用的提取溶剂先后加入20m L的蒸馏水和20m L的分析纯乙腈提取氯虫苯甲酰胺和噻虫胺，振荡提取30m in后，在上述的提取液中加入5 g NaCl，振荡盐析后取1m L的上层有机相。在该提取溶剂中分别加入25、50、75和100mg的PSA、C18和GCB来确定最佳的净化剂和种类和使用量。结果表明，当使用25～100mg的GCB来净化糙米、稻壳和秸秆的1m L提取液时，氯虫苯甲酰胺和噻虫胺在糙米中的回收率在38.4%到88.4%之间，在稻壳中的回收率低于81.6%，而在秸秆中的回收率则为48.2%～87.4%，且随着GCB使用量的增大，其回收率逐渐降低。而当使用25～100mg PSA来净化糙米、稻壳和秸秆的1m L提取液结果发现，当使用75mg的PSA净化糙米提取液时，氯虫苯甲酰胺和噻虫胺的回收率最高，分别为95.2%和94.7%，使用50mg PSA净化稻壳和秸秆提取液时氯虫苯甲酰胺和噻虫胺的回收率最高，在95.6%和99.4%之间。而当使用25mg C18净化糙米的提取液时糙米中氯虫苯甲酰胺和噻虫胺的回收率为96.8%～99.6%，而当C18使用量逐渐增加时，氯虫苯甲酰胺和噻虫胺的回收率逐渐降低，均低于88.4%。由此结果可见过量的C18净化剂能够吸附提取液中的氯虫苯甲酰胺和噻虫胺。在兼顾糙米、稻壳和秸秆中氯虫苯甲酰胺和噻虫胺的添加回收率和使用净化剂的成本，在本方法中选择50mg PSA净化稻壳和秸秆中的杂质，而选择25mg C18净化糙米中的杂质（表3）。

表3 提取溶液中净化剂PSA，C18和GCB的优化

2.3 方法学考察

2.3.1 方法的线性关系和检出限 在1.5中的超高效液相色谱串联质谱条件下，分别测定氯虫苯甲酰胺(0.1、1、10、20、100 μg/L)和噻虫胺(0.1、1、10、20、100、500 μg/L)标准工作溶液，获得氯虫苯甲酰胺和噻虫胺定性离子对的峰面积。以氯虫苯甲酰胺和噻虫胺的标准工作溶液浓度为横坐标，定性离子的峰面积响应值为纵坐标(y)来绘制标准曲线。氯虫苯甲酰胺在0.1～100μg/L线性关系良好，线性回归方程为：y=25143x+13865，相关系数为：R2=0.9998；噻虫胺胺在0.1～500μg/L线性关系良好，线性回归方程为：y=3357x+7819，相关系数为：R2=0.9998。以3倍信噪比(S/N)计算，氯虫苯甲酰胺的检出限为2.95×10-5ng，噻虫胺的检出限为5.79×10-5ng。以低档添加水平为准，氯虫苯甲酰胺和噻虫胺在糙米中的定量限均为0.005mg/kg，在稻壳和秸秆中的定量限均为0.025mg/kg（图3）。

图3 氯虫苯甲酰胺和噻虫胺的线性关系

2.3.2 方法的准确度和精密度 氯虫苯甲酰胺和噻虫胺准确度和精密度的测定采用的是添加回收的方法，在空白的糙米样品中添加浓度为0.005、0.01和0.2mg/kg的氯虫苯甲酰胺和噻虫胺标准溶液，在空白的稻壳和秸秆样品中添加浓度为0.025、0.05和1.0mg/kg的氯虫苯甲酰胺和噻虫胺标准溶液，每个浓度重复5次，并利用1.3和1.5中优化的分析方法进行前处理和测定。通过计算空白糙米、稻壳和秸秆中3个添加水平的氯虫苯甲酰胺和噻虫胺的平均回收率和相对标准偏差(RSD)，以回收率来确定该方法的准确度，而RSD来衡量该方法的精密度。糙米、稻壳和秸秆中氯虫苯甲酰胺和噻虫胺的平均回收率和相对标准偏差见表4。由测定结果可知，氯虫苯甲酰胺在糙米、稻壳和秸秆样品中的加标平均回收率为92.2%～105.4%，相对标准偏差在1.2%～10.1%之间；噻虫胺的平均回收率为83.2%～98.2%，相对标准偏差为2.8%～9.3%。回收率和精密度均满足检测水稻基质中氯虫苯甲酰胺和噻虫胺的方法要求。

表4 氯虫苯甲酰胺和噻虫胺的添加回收率

3 讨论与结论

目前对于同时测定水稻基质中氯虫苯甲酰胺和噻虫胺的高效液相色谱串联质谱的方法并未见报道，仅有两种农药单独的检测方法，而随着氯虫苯甲酰胺和噻虫胺的复配农药的生成和施用，能够同时测定上述两种农药的分析方法便显得尤为重要。本文利用QuEChERS前处理结合超高效液相色谱-串联质谱建立了同时测定氯虫苯甲酰胺和噻虫胺在水稻中的残留分析方法，能够满足农药残留检测的需要。创新点在于建立的方法能够适用于水稻糙米、稻壳和秸秆中的氯虫苯甲酰胺和噻虫胺农药残留的同时测定，分析方法前处理操作简单、节约了试验成本。

对于提取溶剂的选择，目前，常见的用于农药残留的提取溶剂有丙酮、二氯甲烷、正己烷、乙腈、乙酸乙酯等[17-18]，考虑到氯虫苯甲酰胺和噻虫胺的在各种溶剂中的溶解度不同，本研究选用了纯甲醇、50%乙腈和纯乙腈来优化提取溶剂，通过上述3种溶剂在糙米、稻壳和秸秆中氯虫苯甲酰胺和噻虫胺的提取效果，来确定最合适的提取溶剂。由于农药施用后部分农药通过渗透、吸收等方式进入到植物体内，因此这部分的农药需要在加水的情况下才能够更好的被有机溶剂提取出来，因为在水存在的情况下能够将细胞进行软化，增加细胞的通透性，使得有机溶剂能够有效的进入细胞体内，从而能够提高有机溶剂对植物体内农药的提取效率[19]，因此选择50%乙腈水作为氯虫苯甲酰胺和噻虫胺的提取溶剂。对于净化剂的选择，在QuEChERS前处理方法中，最常用的材料包括PSA、GCB、C18等[20]。PSA能够有效的吸附农药残留提取溶剂中的糖类、有机酸以及脂肪酸等一些极性杂质；C18吸附农药残留提取液中脂质、色素等一些非极性的杂质；而GCB具有双面性，最主要的净化效果为吸附提取液中的色素等有色杂质，但GCB对某些特殊的农药也有一定的吸附性[21-22]。对糙米而言，选用C18的净化效果最好，且用量较低。在净化剂PSA中存在两个氨基，而这两个氨基的结构能够有效的结合稻壳和秸秆中的糖类、有机酸、色素和脂肪酸等极性的杂质，而且PSA可以较好的净化稻壳和稻杆中的杂质且对氯虫苯甲酰胺和噻虫胺没有吸附的影响。本文建立的分析方法能够同时准确测定水稻糙米、稻壳和秸秆中的氯虫苯甲酰胺和噻虫胺残留量，在提取方式上未进行详尽的比较试验，且未建立土壤基质中氯虫苯甲酰胺和噻虫胺的前处理和检测方法，应在完善提取方式及在土壤中的残留量做相应方法的试验。

氯虫苯甲酰胺在0.1～100μg/L、噻虫胺胺在0.1～500μg/L线性关系良好，在优化条件的条件下氯虫苯甲酰胺和噻虫胺在糙米、稻壳和秸秆基质中的平均回收率在83.2%～105.4%之间，变异系数为1.2%～10.1%，氯虫苯甲酰胺和噻虫胺的最低检出限分别为2.95×10-5和5.79×10-5ng，在糙米基质中的定量限为0.005mg/kg，在稻壳和秸秆中的定量限均为0.025mg/kg。本研究建立的分析方法能够简单准确、快速有效的同时测定水稻糙米、稻壳和秸秆中的氯虫苯甲酰胺和噻虫胺，该方法完全能够满足农药残留分析要求，适用于大量水稻样品的快速检测，为政府监管提供有效的检测分析手段。