基于SSR分子标记的龙眼种质资源遗传多样性分析及其指纹图谱构建

郭栋梁，黄石连，王 静，韩冬梅，李建光

（广东省农业科学院果树研究所，农业农村部南亚热带果树生物学与遗传资源利用重点实验室，广东省热带亚热带果树研究重点实验室，广州 510641）

0 引言

龙眼(Dimocarpus longan Lour.)，为无患子科(Sapindaceae)，龙眼属(Dimocarpus)植物，是原产中国热带、亚热带地区的珍稀水果之一，栽培历史已有2000多年[1]。95%以上的龙眼种植在东南亚的中国、泰国和越南，其余地区仅澳大利亚、印尼等地有零星栽培。在自然环境的长期影响和人为选择的干预下，中国形成了丰富的龙眼种质资源库[2]，不仅获得了龙眼与荔枝的远缘杂交后代，而且保存了裂叶、焦核、白核、红果皮等具有特殊性状的资源。国家龙眼种质圃（福州）收集保存了来自中国、泰国、越南、印度尼西亚、美国等国家的种质资源343份[3]，广东省农业科学院果树研究所龙眼种质资源圃收集有各种龙眼种质资源150份。丰富的龙眼资源储备是我们研究物种起源进化、挖掘控制特异性状的基因及选育种工作的基础，而对龙眼种质资源进行综合评价及遗传多样性鉴定则是最为关键的基础工作。

近几十年来，由于龙眼产业的迅猛发展，各地区间的种质资源交流日益频繁，无序的引种导致龙眼种质资源同名异物或者同物异名的混乱现象十分突出，资源识别难，追溯难，防伪难成为制约龙眼产业健康发展的关键问题，急需建立一套有效鉴别和区分龙眼种质资源的方法。传统的形态学鉴定法耗时长，易受环境条件的影响，准确性差，已不能适应产业的需求，分子标记凭借操作易、成本低、分辨率高等优点成为植物种质资源鉴定与分类和遗传多样性分析最有效的方法[4]。许多科研工作者应用 RAPD[5-6]、AFLP[7]、ISSR[8]、SRAP[9]等分子标记对龙眼种质资源的遗传多样性进行了分析。

SSR标记具有多态性高、共显性、易检测、重复性高、数量丰富和对基因组有很好的覆盖性等特点，广泛应用于植物遗传多样性、新品种鉴定、分子标记辅助育种(MAS)、遗传连锁图谱的构建、分子指纹图谱的构建等多种方面的研究[10]。近几年，由于转录组测序技术的飞速发展，基于转录组数据开发的SSR分子标记技术被广泛的应用于已在柑橘[11]、荔枝[12]、桃[13]、梨[14]、葡萄[15]、猕猴桃[16]、木瓜[17]、苦荞[18]、大豆[19]等作物上。

龙眼的SSR分子标记开发较晚，傅嘉欣[20]基于基因组SSR数据开发出48对龙眼SSR引物。随着转录组测序技术的进步，依托EST数据开发SSR标记成为更高效的选择，洪仕南[21]以红核子龙眼的转录组数据为基础开发了19对EST-SSR引物，郭栋梁[22]以石硖龙眼顶芽的转录组数据开发了21对有效的EST-SSR引物，胡文舜[23]利用香脆龙眼果实的转录组数据开发的SSR引物分析了5个龙眼近源属的55种材料的遗传多样性。龙眼SSR分子标记的开发为龙眼遗传图谱构建、系谱分析和MAS育种提供高效的分子标记资源。

分子指纹图谱是指在SSR指纹图谱的基础上，基于一定原则对SSR指纹进行字符编码，获得可快速、准确区分不同种质资源的字符串。基于SSR标记的分子指纹图谱研究在桃[24]、苹果[25]、葡萄[26]、梨[27]、枣[28]、山楂[29]等果树资源上已有相关报道，尚未发现利用SSR标记构建龙眼的分子指纹图谱。本研究利用前期已开发的SSR分子标记分析了广东省农业科学院果树研究所龙眼资源圃中保存的85份龙眼种质资源的遗传多样性并建立了分子指纹图谱，旨在为龙眼种质资源的分子鉴定和变异分析提供安全高效的技术支持。

1 材料和方法

1.1 材料

本试验所用85份龙眼种质资源，部分引自福建、四川、广东等省市（表1），部分为近年来杂交获得的优良单株。供试资源均种植于广东省农业科学院果树研究所资源圃中，其生长结果期间的管理水平较为相似。

表1 供试的85份龙眼种质资源

1.2 方法

龙眼叶片基因组DNA提取参照翟世博[30]的方法。龙眼SSR引物选用之前开发的7个龙眼转录组SSR标记[22]，前向引物用Fam荧光修饰（Thermo Scientific，上海）（表2）。龙眼荧光PCR扩增反应体系15μL，其中包括：2*Taq PCR Master M ix 7.5μL，0.1 μmol/LM ix primer2μL，DNA模板1μL(50～200 ng)，ddH2O 4.5μL。扩增反应是在TaKaRa PCRThermal Cycler Dice仪器上进行，扩增程序如下：96℃预变性3min；94℃变性30 s，退火（根据引物合成单上的Tm减2℃）30 s，72℃延伸1m in，30个循环；72℃延伸10min。

表2 SSR引物信息

取1μL的PCR产物加入10μL的Hi-Di甲酰胺和0.5μL的内标，在遗传分析仪ABI3730xl上进行毛细管电泳，利用GeneMapper4.1软件（应用生物系统公司）进行SSR等位片段的检测和标记分型。用数字1和0分别表示实验材料某一等位基因的有无，记录85份龙眼种质资源的扩增结果建立“1-0”数字库。

1.3 数据分析

对Gene Marker软件获得数据用Cervus3.0软件计算等位基因数目和多态性信息量(polymorphism information content,PIC)，利用FSTAT2.9.3.2软件计算基因的多样性。利用NTsys-pc 2.10e软件中的Qualitative data模块对品种间的遗传距离系数(Nei distance)进行分析，以clustering程序中SHAN进行非加权类平均法(unweighted pair group method using arithmetic aaverages,UPGMA)建立所有品种的聚类柱状图。

2 结果和分析

2.1 SSR位点的多态性

利用7对自主开发的转录组SSR引物对85份龙眼种质资源进行扩增，共获得等位基因片段29个，平均每个引物获得4.14个，单个引物获得的等位基因片段数范围为3～7个，其中获得等位基因片段最多为LY2引物，最少的为LY3、LY6、LY7和LY9引物。有效等位基因数(Ne)范围在1.52～3.133之间，平均2.175，有效等位基因所占比例为52.49%。群体平均Shannon遗传多样性指数(I)为0.877，其中LY8最高为1.249，LY7最低为0.55；观测杂合度(Ho)的变化范围为0.341～0.782，平均值为0.51，期望杂合度(He)的变化范围为0.342～0.681，平均值为0.514，He的平均值大于0.5。引物的多态性信息量(PIC)的变化范围为0.238～0.627之间，平均值0.439。7对引物中有3对引物的PIC值大于0.5，为高度多态性信息引物（表3）。

表3 85份龙眼种质资源在7个SSR位点的遗传多样性

2.2 基于毛细管电泳的龙眼种质资源聚类分析

利用UPGMA方法对85份龙眼种质资源进行遗传距离分析，其结果表明，85个龙眼种质资源的遗传距离范围0.00～0.635，平均为0.299。基于Nei’s遗传距离，对85份龙眼种质资源进行聚类分析，建立聚类分析树状图（图1）。结果表明，在遗传距离为0.635，可以将85份龙眼种质资源分为8个类群。第一类群8份资源：大个圆、越南四季、潘通、伊多、0807-2优株、沙梨木、沙梨肉、0405优株；第二类群5份资源：广早、可哈拉、卷叶、石硖、台山广早；第三类群8份资源：新窖乌圆、储良、处暑本、绿珠、巨龙、新滘一号、普明庵、20180723优株；第四类群12份资源：青壳宝圆、罗伞木、水南一号、赐合种、河垌广眼、0807-7优株、白花木、桂明、鸡肾眼、桂花味、鸡卵眼、20180725优株；第五类群13份资源：早白露、东壁、实生迟熟、顶圆、泸早、赤壳、鸡蛋本、草铺种、迟熟龙眼、泸丰、蜀冠、顺德十叶、实生蜀冠；第六类群14份资源：海晏、20180806优株、0807-4优株、友谊106、0731优株、迟龙眼、旺高堂、双孖木、青壳蕉、驼背木、0806优株、凤梨穗、凤梨朵、实生脆肉；第七类群10份资源：香眼、古山二号、水眼、九月乌、立冬本、洲头本、0807-5优株、龙忧、红匣臻、红核子；第八类群15份资源：后巷本、后壁埔、立秋本、东莞大果、福眼、公妈本、20180813优株、20180814-1优株、良圆、0807-1优株、松风本、大乌圆、红核、八一早、乌龙岭。

图1 基于SSR标记的85份龙眼种质资源的UPGMA聚类分析

2.3 85份龙眼种质资源指纹图谱的构建

本研究选取7对SSR标记构建85份龙眼种质资源的指纹图谱，结果如表4所示：7对龙眼SSR标记可以完全将85份龙眼种质资源区分开来，原本被认为同一资源的蜀冠和实生蜀冠被证实为不同资源。单独使用一个引物就可以将10份资源分开，其中LY2引物可以单独将实生迟熟、大个圆、依多、潘通、越南四季、河垌广眼、早白露7个资源分开；LY4引物可以单独将实生脆肉、迟龙眼2个资源分开；LY6引物可以单独将旺高堂分开；LY7引物可以单独将红核、0807-04优株分开；同时使用LY2引物和LY3引物可以将古山二号、实生蜀冠、石硖、白花木、泸早分开；同时使用LY2引物和LY4引物可以将龙忧、后巷本、鸡卵眼、水眼、20180725优株分开；同时使用LY2引物和LY8引物可以将红匣臻、驼背木、公妈本、立冬本、桂花味、洲头本、0806优株分开。

表4 基于7对SSR引物的85份龙眼资源的指纹图谱

续表4

3 讨论与结论

随着生物技术的快速发展，使用分子标记作为品种鉴定、辅助育种、遗传多样性研究成为主要的技术手段。与常用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测技术相比较，荧光标记的毛细管电泳技术具有检测结果稳定、高效、准确等优点，已成为鉴定种质资源多样性的主要手段。目前，还没有利用毛细管电泳对龙眼种质资源进行检测和指纹图谱分析。本研究中，通过优化毛细管电泳的试验条件，统一进样的PCR产物浓度，优化SSR标记的引物，降低毛细管电泳的误差，建立了一套基于SSR荧光标记的毛细管电泳技术的龙眼资源分子指纹技术体系。

SSR分子标记因其简单的操作及稳定可靠的结果成为分子标记中应用最为广泛的一种。除胡文舜[23]使用EST-SSR技术对无患子科5个近源属的种质遗传多样性进行分析外，尚未有使用SSR分子标记技术对龙眼种质资源多样性进行分析的报道。本研究中，笔者从前期自主开发的21对SSR引物中筛选7对引物用于龙眼遗传多样性分析及指纹图谱构建。7对SSR引物的平均多态性信息量(PIC)为0.439，其中只有LY2、LY4、LY8引物的PIC>0.5，尽管使用7对引物可以将85份龙眼资源完全分开，但是对于更大群体的遗传多样性分析尚且不能满足，需要进一步开发更多的适用于龙眼资源分析的SSR引物。

龙眼遗传多样性不高的原因可能是长期的无性繁殖和人工选育减少了品种之间的种质资源交流，基因分化逐渐减少，育种材料的遗传基础日益狭窄。本研究中85份龙眼资源分为8个类群，来自泰国的潘通、伊多、来自越南四季被聚为一类，其结果与曾黎辉[31]使用ISSR对51份龙眼资源进行聚类获得的结果一致。洪自同[32]利用ISSR分子标记技术将35份龙眼样品分为以乌龙岭、东壁、立冬本为代表的3类群体，本研究中乌龙岭、立冬本、东壁、赤壳也被划分为3个独立的群体。易干军[7]使用AFLP分子标记、林同香[33]使用RAPD分子标记、曾黎辉[31]使用ISSR分子标记对龙眼种质资源都进行过聚类分析，获得不同的聚类结果，表明使用不同的分子标记技术获得的龙眼种质资源聚类结果会有差异。

分子指纹图谱是资源的身份证，具有唯一性，是品种鉴定、登记、保存的重要凭证。郑珊等[34]使用11对ISSR引物对40个龙眼品种的遗传多样性进行分析，并建立了数字DNA指纹图谱，不过其鉴定的品种大多为福建本地品种，其遗传多样性较低，易于鉴定。本研究构建了85份来自泰国、越南及中国广东、广西、福建、海南等地区的龙眼资源的指纹图谱，基本覆盖了来自我国龙眼主产区的大部分资源，对于指导龙眼资源的分类，鉴定及合理利用具有重要意义。

本研究利用龙眼SSR分子标记技术，对85份龙眼资源进行群体多样性分析和指纹图谱构建。7对SSR引物共检测到29个等位基因，平均每对引物可检测等位基因4.14个。7对SSR引物可完全将85份龙眼资源完全分开，遗传距离范围为0.00～0.635，表明龙眼资源之间的遗传距离较低。在遗传距离0.635处，85份龙眼资源被分为8个类群。龙眼资源遗传多样性的分析及遗传图谱的建立为龙眼种质资源的鉴定，特别是为生产上许多同名异物和同物异名的乱象鉴定提供了有效手段。