桦褐孔菌多糖的制备工艺优化及其活性研究

郭鑫，包东瑞，赵佳乐，何旭，陈美华，夏广清,3*，臧皓*

(1.通化师范学院医药学院，通化134002；2.通化师范学院长白山生物种质资源研究院，通化134002；3.长白山生物种质资源评价及应用研究院，通化134002；4.通化师范学院生命科学学院，通化134002)

桦褐孔菌(Inonotus obliquus)为锈革孔菌目、锈革孔菌科真菌类[1]，一般生长在树皮下面，干燥后质地坚硬，无臭无味，俗称为桦树茸，是十分重要的一类药用真菌[2]。天然的桦褐孔菌主要分布于俄罗斯、芬兰、波兰、日本北海道等北半球北纬40°～50°的地区和我国的黑龙江省与吉林省一带[3]。桦褐孔菌中具有多种生物活性成分[4]，主要包括多糖类、三萜类、黄酮类、多酚类、黑色素和木质素类等。其中桦褐孔菌中多糖类物质具有一定的抗肿瘤、抗氧化、降血糖和免疫调节等生物活性而受到广泛关注[5-9]。

本实验采用酶法对桦褐孔菌多糖进行提取，以香菇柄多糖的提取方法为参照[10]，优化酶法提取桦褐孔菌多糖工艺，并对所得多糖进行了相关抗氧化和降糖活性评价，旨在为桦褐孔菌的进一步开发与利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

桦褐孔菌，吉林弘毅特产有限公司；果胶酶（30000U/mg）、纤维素酶（10000U/mg）、木瓜蛋白酶（＞200U/mg），麦克林；磺胺（99%）、奈乙二胺二盐酸盐、无水磷酸二氢钾（99.5%）、无水磷酸氢二钾（99%）、无水磷酸氢二钠（99%）、无水磷酸二氢钠（99%），萨恩化学；苯酚（99%）、Trolox、3，5-二羟基苯甲酸、可溶性淀粉，西亚化学；酒石酸钾钠、α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶、硝普钠、阿卡波糖，美国sigma公司；NaOH、HCl、乙醇等常规化学试剂均为国产分析纯。

VDHG-9245A型恒温箱，上海一恒科技有限公司；TDL-5-A型号低速大容量离心机，上海安亭科学仪器；高速中药粉碎机，浙江瑞安市永历制药机械有限公司；磁力搅拌器，北京欣维尔玻璃仪器有限公司；HWS12型电热恒温水浴锅，上海-恒科技有限公司；ZNCL-G190×90磁力搅拌器，巩义市予华仪器有限责任公司；电热鼓风干燥箱，上海-恒科学仪器有限公司；HY-2旋涡混匀仪，上海仪电科学仪器股份有限公司；ReadMax1900Plus型光吸收酶标仪，上海闪普生物科技公司；BSA224S-CW型电子天平，赛多利斯科学仪器。

1.2 实验方法

1.2.1 水提法

桦褐孔菌以料液比1∶40加入蒸馏水溶液，置于95℃磁力搅拌水浴锅内进行提取2h后，离心沉淀，取上清液，水浴蒸发浓缩至10mL，加入4倍体积95 %乙醇，4℃静置过夜，4000r/min离心20min，收集沉淀，60℃真空干燥至恒重，即得粗多糖。

1.2.2 碱提法

桦褐孔菌以料液比1∶40加入5% NaOH溶液，放置于95℃磁力搅拌水浴锅内2h，进行提取后，离心沉淀，取上清液，水浴蒸发浓缩至10mL，加入4倍体积95 %乙醇，边加边搅拌，4℃静置过夜，4000r/min离心20min，收集沉淀，60℃真空干燥至恒重，即得粗多糖。

1.2.3 酶解法制备桦褐孔菌多糖工艺

桦褐孔菌以料液比1∶40加入pH为5.0的盐酸溶液，在50℃下酶解2h，离心沉淀，取上清液，水浴蒸发浓缩至10mL，加入4倍体积95 %乙醇，4℃静置过夜，4000r/min离心20min，收集沉淀，60℃真空干燥至恒重，即得粗多糖。详见表1。

表1 不同酶最适水解参数Tab.1 Optimal hydrolysis parameters of different proteases

1.2.4 多糖含量的测定

1.2.4.1 葡萄糖标准曲线的测定

采用苯酚硫酸法[11]进行多糖含量测定。称取葡萄糖10mg，配制成1.0mg/mL的葡萄糖溶液，取不同体积的该溶液，用蒸馏水水配制成0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.16、0.20mg/mL的葡萄糖溶液，向EP管中依次加入葡萄糖各浓度样品溶液250μL、苯酚溶液125μL、硫酸625μL，混合静置30min后取出200μL加入到96孔板中，进行3次平行实验，于490nm测定吸光度值。

1.2.4.2 样品的多糖含量测定

向EP管中依次加入样品溶液250μL、苯酚溶液125μL、硫酸625μL，混合静置30min后取出200μL加入到96孔板中，进行3次平行实验，于490nm测定吸光度值。

1.2.5 果胶酶酶解桦褐孔菌多糖的工艺优化

1.2.5.1 单因素实验

考查pH、添加酶的量、酶解时间以及酶解温度对多糖含量的影响。固定反应条件添加酶的量9500U/g，酶解时间3h，酶解温度55℃，考察不同溶液pH（2、3、4、5、6）对多糖含量的影响；固定反应条件酶解溶液的pH 4，酶解时间3h，提取温度55℃，考察酶添加量（5500、6500、7500、8500、9500U/g）对多糖含量的影响；固定反应条件溶液的pH4，添加酶的量9500U/g，酶解温度55℃，考察不同酶解时间（1.5、2、2.5、3、3.5h）对多糖含量的影响；固定反应条件溶液的pH4，添加酶的量9500U/g，酶解时间3h，考察不同酶解温度（40、45、50、55、60℃）对多糖含量的影响。

1.2.5.2 正交试验设计

正交试验优化果胶酶酶解桦褐孔菌多糖工艺参数，根据果胶酶最优提取条件及单因素试验结果，选用L9（34）正交试验设计，探讨pH（A）、酶添加量（B）、酶解时间（C）及酶解温度（D）对多糖含量的影响，得到果胶酶酶解桦褐孔菌多糖的最佳条件。详见表2。

表2 正交试验因素与水平Tab.2 Factors and levels in orthogonal experiments

1.2.6 分析测定方法

1.2.6.1 抗氧化活性研究

1.2.6.1.1 NO清除实验

参照文献[12]的方法，略有改动。取1mg/mL的桦褐孔菌多糖溶液3mL，同时另取与桦褐孔菌多糖相同浓度的阳性对照姜黄素溶液3mL分别与3mL硝普钠（5mmol/L）充分混匀，25℃下反应300min，在0、25、50、75、100、150、200、250、300min各取100μL，分别加100μL Greiss试剂后混合，于546nm波长下测定桦褐孔菌多糖对NO清除能力；甲醇溶液3mL与3mL硝普钠（5mmol/L）充分混匀，25℃下反应300min，在0、25、50、75、100、150、200、250、300min各取100 μL，分别加100 μL Greiss试剂后混合，作为空白组。于546nm波长下检测样本组、阳性组和空白组的吸光度值。

1.2.6.1.2 清除·OH自由基的能力

参照[13]的方法，略有改动。桦褐孔菌多糖样品及阳性参比溶液配制同1.2.6.1.1。配制3mM/L的FeSO4水溶液、3mM/L的过氧化氢溶液、6mM/L的水杨酸溶液备用。在50μL 3mM的FeSO4加入50μL样品溶液以及50μL 3mM的过氧化氢溶液后混匀，静置反应10min，再加50μL 6mM的水杨酸溶液，混匀，静置反应30min。测定其在492nm处的吸光度值记为As，进行3次平行实验；在50μL 3mM的FeSO4加入50μL样品溶液以及50μL 3mM的过氧化氢溶液后混匀，静置反应10min，再加50μL的蒸馏水，混匀，静置反应30min。测定其在492nm处的吸光度值记为Ac；在50μL 3mM的FeSO4加入50μL蒸馏水以及50μL 3mM的过氧化氢溶液后混匀，静置反应10min，再加50μL 6mM的水杨酸溶液，混匀，静置反应30min。测定其在492nm处的吸光度值记为Ab；以Trolox作为阳性对照。按下列公式计算清除率。

清除率(%)=[1-(As-Ac)/Ab]×100

1.2.6.2 降糖活性研究

1.2.6.2.1 α-葡萄糖苷酶的抑制

参照[14]的方法，略有改动。桦褐孔菌多糖样品及阿卡波糖阳性参比溶液配制均采用DMSO。配制0.1mM的PBS、5mM PNPG溶液和0.1U/mL α-葡萄糖苷酶。在96孔板中加入20μL样品、80μL 0.1M PBS和100 μL 0.1U/mL α-葡萄糖苷酶于25℃孵化10 min后，加入50 μL l 5 mM PNPG于25℃孵化5 min。分别在0 min、5 min时在405 nm波长下测定吸光值记为As，进行3次平行实验；在96孔板中加入20 μL DMSO、80 μL 0.1M PBS和100 μL 0.1U/mL α-葡萄糖苷酶于25℃孵化10 min后，加入50 μL l5 mM PNPG于25℃孵化5 min。分别在0 min、5 min时在405 nm波长下测定吸光值记为Ab；以阿卡波糖作为阳性对照。按下列公式计算抑制率。

抑制率(%)=[(A5min-A0min)b-(A5min-A0min)s]/(A5min-A0min)b×100

1.2.6.2.2 α-淀粉酶的抑制

参照[15]的方法，略有改动。桦褐孔菌多糖样品及阿卡波糖阳性参比溶液配制均采用DMSO。配制20 mM的PBS、DNS溶液、4 U/mL α-淀粉酶和0.5%（w/v）淀粉。在EP管中加入20 μL样品、80 μL蒸馏水和100 μL 4U/mL α-淀粉酶25℃孵化5 min，加入200 μL 0.5%淀粉于25℃孵化3 min后，取200 μL上述混合液和100 μL DNS溶液加入新的EP管85℃水浴反应15 min，待冷却至室温后加入900 μL蒸馏水稀释，在540 nm波长下测定吸光值记为As，进行3次平行实验；在EP管中加入20 μL样品、80 μL蒸馏水和100 μL PBS 25℃孵化5 min，加入200 μL 0.5%淀粉于25℃孵化3 min后，取200 μL上述混合液和100 μL DNS溶液加入新的EP管85℃水浴反应15min，待冷却至室温后加入900 μL蒸馏水稀释，在540 nm波长下测定吸光值记为Ac；在EP管中加入20 μL DMSO、80 μL蒸馏水和100 μL 4U/mL α-淀粉酶25℃孵化5 min，加入200 μL 0.5%淀粉于25℃孵化3 min后，取200 μL上述混合液和100 μLDNS溶液加入新的EP管85℃水浴反应15 min，待冷却至室温后加入900 μL蒸馏水稀释，在540 nm波长下测定吸光值记为Ab；以阿卡波糖作为阳性对照。按下列公式计算抑制率。

抑制率(%)=[1-(As-Ac)/Ab]×100

1.3 数据处理

利用SPSS 17.0软件处理数据来进行差异性显著分析，其中P<0.05差异显著；Office excel 2003软件进行数据处理及绘图，每次试验设计3个平行，结果用平均值±标准差来表示。

2 结果与分析

2.1 多糖含量测定

2.1.1 葡萄糖的标准曲线，详见图1。

以葡萄糖浓度（mg/mL）为横坐标，吸光值（A）为纵坐标作图，得到标准曲线y=0.0079x-0.0588 R2=0.9991。将待测的样品的吸光度值带入葡萄糖标准曲线中计算提取物中的多糖含量。

2.1.2 各方法下的提取物多糖含量

如表3所示，不同方法所得的提取物多糖含量存在一定的差异。酶法提取物所得多糖含量均显著高于水提法和碱提法，以果胶酶最优，其次为木瓜蛋白酶和纤维素酶；与酶法提取相比，碱提法次之，水提法所得提取物多糖含量最少。故选择酶法提取中的果胶酶酶解提取法进行后续的工艺优化。

表3 提取物多糖含量Tab.3 Extract polysaccharide content

2.2 果胶酶酶解桦褐孔菌多糖单因素实验结果

2.2.1 pH对果胶酶酶解桦褐孔菌多糖含量的影响

由图2可以看出，桦褐孔菌多糖的含量随着pH的增加逐渐增大，当pH 5时，达到最大值。但在此之后随着pH值的进一步增大，反而是抑制了果胶酶酶解的效率，降低了桦褐孔菌多糖的得率。因此，在本试验条件下，适宜的pH值为5。

2.2.2 酶添加量对果胶酶酶解桦褐孔菌多糖含量的影响

由图3可以看出，随着酶添加量的不断增加，桦褐孔菌多糖的含量呈现显著的升高趋势（P<0.05）。在酶添加量达到9500 U/g时，桦褐孔菌多糖含量达到最大值。因此，选择酶添加量9500 U/g时为最佳酶添加量。

2.2.3 酶解时间对果胶酶酶解桦褐孔菌多糖含量的影响

由图4可以看出，随着酶解时间的延长，桦褐孔菌多糖含量在1.5～2.5 h之间呈现下降的趋势；但此后随着酶解时间的增加，增加酶解时间使得桦褐孔菌多糖提取量不断增加，在3 h时达到最高，之后延长时间提取率的变化不显著（P＞0.05）。所以，考虑到节约资源和成本选择适宜酶解时间为3 h。

2.2.4 酶解温度对果胶酶酶解桦褐孔菌多糖含量的影响

由图5可以看出，在温度40～50℃范围内，随着温度升高，桦褐孔菌多糖含量变化不显著（P＞0.05）。当温度为50℃时，桦褐孔菌多糖含量达到最大值，超过50℃后，桦褐孔菌多糖含量显著下降（P<0.05），所以选择适宜酶解温度为50℃。

2.3 果胶酶酶解桦褐孔菌正交试验结果

在单因素实验基础上，以多糖含量为评价指标，利用正交试验筛选出果胶酶提取桦褐孔菌多糖的最佳工艺参数，结果见表4。

表4 酶解桦褐孔菌正交试验设计及结果Table.4 Orthogonal test design and results of enzymatic hydrolysis of Inonotus obliquus

由极差分析可得出影响果胶酶酶解桦褐孔菌工艺的主次因素为pH＞提取温度＞酶解时间＞加酶量，最佳提取条件是A1B3C2D3，即提取pH 4、加酶量9500 U/mg、酶解时间3 h、提取温度55℃。按最佳理论条件进行实验，测得多糖含量（0.1598±0.013）mg Glu/g提取物。

2.4 抗氧化活性实验结果

2.4.1 桦褐孔菌多糖清除NO的能力

桦褐孔菌多糖可有效的清除试验体系中的NO，姜黄素溶液对NO的清除效果非常显著，如图6所示，与姜黄素相比，1 mg/mL的桦褐孔菌多糖在0～300 min内清除率与桦褐孔菌多糖浓度呈剂量依赖关系，随桦褐孔菌多糖浓度增加，清除率也逐渐升高，150～250 min时，清除率明显增加，桦褐孔菌多糖在250 min时，清除率最高。

2.4.2 清除羟基自由基的能力

桦褐孔菌多糖对试验体系中的羟自由基有显著的清除作用（P<0.05），如图7所示，Trolox溶液对羟基的清除效果非常显著，与Trolox相比，当桦褐孔菌多糖质量浓度小于4 mg/mL时，清除率显著升高；当浓度大于4 mg/mL时，随着桦褐孔菌多糖浓度增加，羟自由基的清除率变化不显著；在5 mg/mL时达最大清除率83.44%。

2.5 降糖活性实验结果

2.5.1 α-葡萄糖苷酶抑制活性

桦褐孔菌多糖对试验体系中的α-葡萄糖苷酶有显著的抑制作用（P<0.05），如图8所示，阿卡波糖溶液对α-葡萄糖苷酶的抑制效果非常显著，与阿卡波糖相比，当桦褐孔菌多糖质量浓度小于0.25 mg/mL时，清除率显著升高；当浓度大于0.25 mg/mL时，随着桦褐孔菌多糖浓度增加，α-葡萄糖苷酶的抑制率缓慢升高，差异不显著；在1 mg/mL时达最大抑制率92.15%。

2.5.2 α-淀粉酶抑制活性

桦褐孔菌多糖对试验体系中的α-淀粉酶有显著的抑制作用（P<0.05），如图9所示，阿卡波糖溶液对α-淀粉酶的抑制效果非常显著，与阿卡波糖相比，当桦褐孔菌多糖质量浓度小于5 mg/mL时，清除率显著升高（P<0.05）；在桦褐孔菌多糖浓度为5 mg/mL时达最大抑制率39.78%。

3 结论

果胶酶酶解最佳工艺为：提取pH 4、加酶量9500 U/g、酶解时间3 h、提取温度55℃。经过验证，在此条件下的桦褐孔菌多糖含量为（0.1598±0.013）mg Glu/g提取物。多糖对NO、羟基自由基有较好的清除能力，以及对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶具有较好的抑制作用，显示出了较好的抗氧化活性及降糖活性。因此，实验所得的果胶酶的酶解条件对桦褐孔菌食品药品的相关方向研究具有重要意义。本实验中仅以桦褐孔菌多糖产物作为研究对象，进行了体外抗氧化以及降糖活性研究，并未研究其内在的药理功效，可进一步进行相关物质的提取纯化以及深入的药理学试验研究，进一步探索桦褐孔菌的药理活性及保健功效，为今后桦褐孔菌的开发与利用提供理论基础。