发酵协同多酚复合对大米淀粉消化性能的影响

李晓玺 沈少丹 陆萍 陈玲 李琳

(华南理工大学 淀粉与植物蛋白深加工教育部工程研究中心/天然产物绿色加工与产品安全广东省重点实验室/食品科学与工程学院，广东 广州 510640)

大米作为重要的碳水化合物来源，其主要组分淀粉的消化速度与程度决定了其营养功能。研究表明，快消化淀粉(RDS)含量高的食品可快速为人体提供能量，但会引起人体餐后较高的血糖水平[1]，长期摄入易导致高血糖、高血脂及肥胖症等慢性代谢性疾病发生的风险[2- 3]；而慢消化淀粉(SDS)和抗消化淀粉(RS)则在控制人体体重、改善氧化应激反应、调节血糖血脂代谢水平等营养功能方面发挥重要作用[4- 5]。在食品加工过程中，大米淀粉的结构发生变化并与其他组分发生相互作用，从而形成特定的多尺度结构并显著引起消化性能的变化[6- 7]，继而改变大米及其米制品的消化性能和餐后血糖水平[6，8- 10]。

多酚是一种重要的植物次生代谢物，具有抑制酶活性、调节人体免疫疾病等多种功效，其可与淀粉分子链上的多羟基通过氢键分子间相互作用形成复合物或可通过疏水相互作用进入直链淀粉的疏水空腔形成V 型复合物，改变淀粉的结构有序性，影响淀粉酶的作用程度，从而影响食品的消化性能[8，11- 12]。淀粉-多酚复合物形成受多酚和淀粉的结构[11，13]、复合的方式[14- 16]和多酚添加量等因素影响。因此，通过改变多酚与淀粉的复合条件可影响多酚与淀粉的作用方式，进而引起淀粉消化性能的变化。而微生物发酵是米制品加工的重要加工方法[17]，在发酵过程中淀粉被胞外淀粉酶和葡萄糖苷酶水解，导致淀粉分子降解、螺旋解体、结晶结构破坏等多尺度结构变化[18- 19]，使得淀粉分子的自由度增加，从而有利于促进淀粉与多酚的复合。

因此，本研究利用发酵大米淀粉与广泛存在于紫米、紫薯中的原花青素C1进行复合，系统研究原花青素C1复合后发酵大米淀粉的多尺度结构及消化性能的变化规律，揭示原花青素 C1与发酵大米淀粉复合行为对发酵大米淀粉消化性能影响的关键结构域及其机理，可为发酵米制品的营养功能调控和功能米制品的创制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

大米，购自东莞市太粮米业有限公司；原花青素C1，购于陕西森弗天然制品有限公司，食品级，纯度80%；安琪酵母菌，购于安琪酵母股份有限公司，食品级；猪胰α-淀粉酶，购于Sigma试剂有限公司，P- 7545；淀粉葡萄糖苷酶，购于Sigma试剂有限公司，A- 3360；其他所用试剂均为分析级。

722型紫外可见分光光度计，上海第三分析仪器厂生产；BC1500型恒温恒湿箱，上海一恒科学仪器有限公司生产；EVO18型扫描电子显微镜，德国ZEISS公司生产；SAXSess型小角X射线散射仪，奥地利Anton Paar公司生产；X’PerProx型广角 X 射线衍射仪，荷兰Panalytial公司生产；HD400型固体核磁共振仪、Tensor 37型傅里叶红外光谱仪，德国Bruker公司生产。

1.2 实验方法

1.2.1 发酵大米淀粉的制备

选用酵母菌和乳酸菌为发酵剂，酵母菌/乳酸菌质量比为3：1，发酵剂总添加量为7%，固定发酵温度为37 ℃，对大米进行发酵：称取100 g大米(干基)，按大米与水为1：1.2的比例配成浆液，再加入提前于40 ℃水中活化的混合发酵剂，混合均匀后于37 ℃发酵3 h后，采用碱提法提取大米淀粉[20]，经冷冻干燥，粉碎过100目筛，待用。

1.2.2 发酵大米淀粉-原花青素复合物的制备

将2%、4%、8%(质量分数，占发酵大米淀粉干基质量的比例)的原花青素C1分散于50%乙醇溶液，并在37 ℃下与发酵大米淀粉混合，在搅拌速度500 r/min下复合30 min后，经反复离心洗涤，用香草醛-硫酸法检测上清液中原花青素含量[21]，洗涤至上清液中无原花青素检出，冷冻干燥，粉碎过100目筛待用。不同原花青素C1添加量下得到的发酵大米淀粉-原花青素复合物分别记为FRS- 2PC、FRS- 4PC和FRS- 8PC。

1.2.3 体外消化性能测定

根据Englyst方法[22]，称取适量含有1 g淀粉的复合物样品，加入20 mL乙酸盐缓冲液(0.1 mol/L，pH 5.2)及6枚玻璃珠，再加入5 mL混合消化酶溶液(猪胰α-淀粉酶及淀粉葡萄糖苷酶)并于37 ℃恒温振荡器(170 r/min)中模拟体内消化过程。经消化20 min和120 min后取0.5 mL反应液加于 20 mL 70%乙醇中灭酶，于4 000 r/min离心5 min后取上清液0.1 mL，通过葡萄糖氧化试剂盒溶液显色后，在510 nm处测定样品的吸光值，并以1 mg/mL的标准葡萄糖为参比计算葡萄糖含量。

根据水解速率和葡萄糖含量测定，计算发酵大米淀粉-原花青素复合物的RDS含量、SDS含量和RS含量，分别为：

ωRDS=ρG20×0.9×100%，

ωSDS=(ρG120-ρG20)×0.9×100%，

ωRS=(T-ωRDS-ωSDS)×100%。

其中，ρG20和ρG120分别表示淀粉经消化20 min及 120 min 后的葡萄糖含量，T表示总淀粉含量。

1.2.4 颗粒形貌分析

将复合物粉末均匀散在贴有导电胶的样品台，吹去多余样品后，置于E- 1045型离子溅射仪的样品舱中，在15 mA的电流下喷金处理，置于扫描电子显微镜腔体内进行观察，拍摄颗粒形貌照片。

1.2.5 半结晶层状结构分析

称取一定质量的干基复合物粉末配制成质量分数为30%的淀粉乳，将其于25 ℃下平衡12 h后，在CuKα源的X射线(λ=0.154 2 nm)、电流50 mA和电压40 kV下测定5 min。测定结束后，利用PerkinElmer存储荧光系统的IP读取器软件收集记录在图像板中的数据，并用SAXSquant 3.0软件和SAXSquant 2D软件进行归一化、扣空白和消模糊处理，分析半结晶层状结构特征变化[9，23]。

1.2.6 结晶结构分析

将复合物粉末于恒湿环境中平衡12 h后进行X射线衍射测试，条件如下：电压40 kV，电流200 mA，衍射角(2θ)的旋转范围为5°～40°，扫描速度为1.2 °/min，步长为0.02 °。测试结束后，利用Peakfit v4.12软件计算结晶度及A型和V型结晶比例的变化[7]。

1.2.7 螺旋结构分析

将复合物粉末置于4 mm高分辨魔角旋转探头(MAS)上，于室温(25 ℃)下进行13C CP/MAS NMR测定，测试条件为：共振频率150.9 MHz，转速10 000 kHz，90 °脉冲宽度5 μs，接触时间1 ms，延迟时间5 s，累加次数2 400次以上。以充分糊化的蜡质玉米淀粉在液氮下急冻作为无定型淀粉对照样品，对样品的无定型区域进行归一化处理，将C1峰进行分峰拟合处理，计算样品单螺旋和双螺旋含量变化[24]。

1.2.8 表面有序结构分析

称取一定量的复合物粉末，放置于衰减全反射(ATR)工作平台，在4 000至400 cm-1范围内以 4 cm-1分辨率扫描64次，以空气为背景，扫描结束后可获得红外光谱图，并对其进行基线自动校正和归一化、去卷积(半峰19，增强因子1.9)处理；选择800～1 200 cm-1的光谱图通过Peakfit v4.12进行分峰处理，可获得1 042和1 014cm-1处的强度比值(R1 042/1 014)，其可用来表征复合物颗粒表面的短程有序结构的变化[7]。

1.2.9 数据处理及分析

所有实验均重复3次，实验结果使用SPSS 20.0(IBM，美国)软件进行统计分析，应用ANOVA分析(LSD法假定方差齐性)各组结果间的显著性差异水平(P<0.05)。

2 结果与讨论

2.1 原花青素复合对发酵大米淀粉消化性能的影响

不同原花青素添加量对发酵大米淀粉-原花青素复合物的消化性能的影响见表1。

表1 不同原花青素添加量的发酵大米淀粉复合物的消化特性1)Table 1 Digestibility of fermented rice starch-procyanidine complexes prepared with different amount of procyanidine

发酵大米淀粉与原花青素复合之后，快消化淀粉RDS和慢消化淀粉SDS含量随原花青素复合量的增加逐步降低，而RS含量则显著提高。当原花青素添加量为8%时，SDS和RS含量分别为(33.12±3.85)%和(47.43±3.85)%。这可能是由于发酵大米淀粉与原花青素相互作用改变了发酵大米淀粉的多尺度结构，从而限制了淀粉酶对淀粉分子链的水解作用。进一步采用现代分析技术对原花青素复合后发酵大米淀粉的多尺度结构进行分析，以揭示其多尺度结构变化对消化特性的影响。

2.2 原花青素复合对发酵大米淀粉表面形貌的影响

通过扫描电镜对原花青素复合后发酵大米淀粉的颗粒微观结构进行观察，结果见图1。

(a)FRS (b)FRS- 2PC

(c)FRS- 4PC (d)FRS- 8PC图1 发酵大米淀粉与不同量原花青素复合物的表面形貌Fig.1 Morphology of fermented starch and its complexes with different amount of procyanidine

与原花青素复合后发酵大米淀粉颗粒表面同样遭到酶、酸的侵蚀出现凹陷(虚线区域)，尺寸为2～8 μm，且表面变得更为粗糙。但随着原花青素复合量增大，发酵大米淀粉颗粒整体表面形貌无显著变化。

2.3 原花青素复合对发酵大米淀粉半结晶层状结构的影响

通过小角X射线散射技术测定发酵大米淀粉-原花青素复合物的层状结构变化，由图2(a)可知，发酵大米淀粉及发酵大米淀粉-原花青素复合物在0.65 nm-1处均有一散射峰。其对应大米淀粉颗粒约为9.66 nm的半结晶层状结构[25]。但随着原花青素添加量的增加，该散射峰的强度逐渐降低。通过Lorentz变换(q～I(q2)，其中q为SAXS的散射矢量，I为SAXS的散射信号)处理(见图2(b))发现，复合物半结晶层状结构的Lorentz曲线峰面积(表2中Apeak)均低于发酵大米淀粉的峰面积，且随原花青素复合量的增大而逐渐降低，表明发酵大米淀粉-原花青素复合物半结晶层状结构的结晶区有序化程度降低。在其他淀粉与多酚复合的相关研究[23]中也表现为相似的规律。

参照Chi、Qiao等[23，26]的方法，利用一维线性相关函数f(rw)(见图2(c))解析了半结晶层状结构厚度的变化情况。与发酵大米淀粉相比，原花青素的复合引起发酵大米淀粉半结晶层厚度和结晶层厚度增大、无定型层厚度减小。原花青素可通过氢键、疏水相互作用等非共价相互作用与无定型层区淀粉分子链复合，促进了无定型层区淀粉分子链向相对有序化结构的转变，从而增大结晶层的厚度，降低无定型层厚度。

进一步对发酵大米淀粉-原花青素复合物纳米聚集体的有序化程度研究发现(见图2(d)及表2)，其分形维数均小于3。这表明发酵大米淀粉及发酵大米淀粉-原花青素复合物均表现为质量分形结构[27- 28]。与较低复合量(≤4%)的原花青素复合后，发酵大米淀粉-原花青素复合物的分形维数增大，表明发酵大米淀粉-原花青素复合物纳米聚集体结构有序化程度增加。而当原花青素复合量增加为8%时，复合物的分形维数降低，说明原花青素的增多不利于发酵大米淀粉-原花青素复合物纳米聚集体有序结构的形成。

(a)双对数图

(b)Lorentzt变换图谱

(c)线性相关函数图

(d)分形结构图图2 发酵大米淀粉-原花青素复合物的小角X射线散射图谱Fig.2 SAXS patterns of procyanidine-fermented rice starch complex

2.4 原花青素复合对发酵大米淀粉结晶结构的影响

发酵大米淀粉与不同量原花青素形成的复合物的X射线衍射图谱见图3，其相对结晶度及A型和V型结晶结构比例的变化情况见表2。发酵大米淀粉与原花青素复合后，其复合物的结晶结构仍为A+V型结晶结构，但其特征衍射峰强度降低，说明原花青素复合后，复合物中处于结晶区域的淀粉分子链向“无序化”转变。由表2可知，发酵大米淀粉-原花青素复合物的A型结晶结构比例降低，且随原花青素复合量的增大而略有降低。这与发酵大米淀粉-原花青素复合物半结晶层状结构的结晶区有序化程度降低的结论一致。

图3 发酵大米淀粉与不同量原花青素形成的复合物的X射线衍射图谱Fig.3 XRD pattern of fermented rice starch complexes with different amount of procyanidine

表2 原花青素与发酵大米淀粉复合物的FTIR、XRD、SAXS和NMR测定结果Table 2 FTIR，XRD，SAXS and NMR result of fermented rice starch and FRS-PC complex

同时，发现当添加的原花青素量较低时(≤4%)，发酵大米淀粉-原花青素复合物的V型结晶结构比例稍降低；而原花青素量增加至8%时，复合物的V型结晶结构比例增大。这表明，在较低量的原花青素复合过程中，原花青素与发酵大米淀粉分子链相互作用可使部分降解的淀粉分子链自组装形成的螺旋结构解旋(与相关研究[29]的结果一致)，从而使得V型结晶结构比例稍降低。而较高量的原花青素在复合过程中，原花青素分子作为分子配体可改变部分降解的大米淀粉直链分子糖苷键的排列形式，从而促进部分淀粉分子链形成V型结晶结构[12，30]。

2.5 原花青素复合对发酵大米淀粉螺旋结构的影响

添加不同原花青素形成的发酵大米淀粉-原花青素复合物的CP/MAS13C NMR图谱见图4，通过对C1和C4位置的共振吸收峰进行分峰处理分析得到其螺旋结构变化情况，见表2。发酵大米淀粉与原花青素复合后，淀粉的双螺旋结构和有序化结构比例降低，单螺旋结构和无序化结构增加，且随着原花青素量的增大，发酵后大米淀粉颗粒半结晶层状结构内部分子链整体排列的“无序化”程度增强。由于原花青素与淀粉分子链的相互作用可破坏双螺旋结构的缔合与排列，抑制部分降解后的淀粉分子链自组装成双螺旋结构，而使得双螺旋结构减少[29，31]。

图4 发酵大米淀粉与不同添加量原花青素形成的复合物的13C CP/MAS NMR图谱Fig.4 13C CP/MAS NMR spectra of fermented rice starch complexes with different amount of procyanidine

此外，在较低量的原花青素复合过程中，原花青素与发酵大米淀粉分子链相互作用可使部分降解的淀粉分子链自组装形成的螺旋结构解旋，从而使得单螺旋结构比例稍降低。而较高量的原花青素复合过程中，原花青素分子作为分子配体可改变部分降解的大米淀粉直链分子糖苷键的排列形式，促进部分淀粉直链分子链形成单螺旋结构[30]。但由于复合物颗粒整体结晶度降低(见图3)，复合物整体无序化程度增加。

2.6 原花青素复合对发酵大米淀粉表面有序结构的影响

原花青素与发酵大米淀粉复合形成的复合物红外光谱见图5，其1 042及1 014 cm-1处吸收峰的强度比值见表2。

图5 发酵大米淀粉与不同添加量原花青素形成的复合物的红外光谱图Fig.5 Infrared spectrogram of fermented rice starch complexes with different amount of procyanidine

发酵大米淀粉-原花青素复合物的R1 042/1 014显著增大，且随着原花青素复合量的增加R1 042/1 014增大的程度提高。这表明原花青素的复合引起发酵大米淀粉颗粒表面结构有序化程度的提高[32]，主要是由于原花青素的复合可以使部分降解后的无定型背景区直链淀粉分子链间聚集、无定型区降解后的部分支链淀粉中直链淀粉分子链发生重排，从而使其短程有序结构提升[33- 34]。

2.7 发酵大米淀粉-原花青素复合物的消化性能和多尺度结构的相关性及机制分析

为了揭示发酵大米淀粉-原花青素复合物的消化特性与多尺度结构变化之间的关系，进行Pearson相关性分析，见图6。与原花青素复合后，发酵大米淀粉的RDS含量与单螺旋结构比例(r=-0.97，P<0.05)及短程有序化程度R1 047/1 014(r=-0.98，P<0.05)呈显著负相关，与双螺旋结构(r=0.98，P<0.05)和半结晶层状结构的Lorentz曲线峰面积Apeak(r=0.99，P<0.01)呈显著正相关。这主要是由于原花青素与淀粉分子链之间的相互作用破坏了双螺旋结构的缔合排列从而降低了其长程结构有序化程度，但增加了其单螺旋结构比例及短程结构有序化程度，因而RDS含量仍保持下降趋势，从而体现为正相关趋势[34]；此外，SDS含量与A型结构比例(r=0.98，P<0.05)及无定形层厚度da(r=0.97，P<0.05)为显著正相关关系，与无定形结构比例(r=-0.91)及单螺旋结构比例(r=-0.83)为负相关关系；而RS含量与多尺度结构的相关性规律则与RDS含量规律相反，其与双螺旋结构含量(r=-0.995，P<0.01)和半结晶层状结构的Lorentz曲线峰面积Apeak(r=-0.99，P<0.01)表现为显著负相关，与短程有序化程度R1 042/1 014(r=0.95)和单螺旋结构(r=0.92)为正相关。基于以上相关性分析，说明原花青素通过分子间相互作用与淀粉分子复合后可引起多尺度结构变化从而影响其消化特性，且其中单螺旋结构、双螺旋结构、短程有序结构、A型结晶结构及无定形层结构变化是引起慢消化和抗消化结构形成的主要因素。

图6 FRS-PC复合物的消化特性及多尺度结构的Pearson相关性分析Fig.6 Pearson correlation coefficients of starch digestibility and multi-scale structures of FRS-PC complex

综合上述研究可知，随着原花青素复合量提升，发酵大米淀粉颗粒内部聚集体分形维数增大、聚集体有序化程度增强，半结晶层状结构的厚度及半结晶层状结构结晶区厚度增大、无定型厚度降低、单螺旋结构比例提高、V型结晶结构增多、短程有序化程度提高，且同时表现为RS含量增加和RDS与SDS含量降低，表明原花青素的“无序化效应”诱导大米淀粉原有有序结构解组装的同时又以“分子配体”的形式促进部分降解后的淀粉分子链间形成新的相对有序结构，因此引起发酵大米淀粉抗消化性能的提升。

另一方面，与原花青素复合后，发酵大米淀粉的半结晶层状结构结晶区淀粉分子链有序性降低、结晶度和A型结晶结构比例下降，双螺旋结构比例和有序结构减少、无序结构增加，但并未引起RDS含量的提高和RS含量的降低；主要原因是在消化过程中处于淀粉无序化结构区域的原花青素由于淀粉分子的降解而不断解离出来并抑制淀粉酶活性，从而整体上协同提升发酵大米淀粉的抗消化特性[35- 36]。

3 结论

通过系统考察发酵大米淀粉与原花青素复合对淀粉消化性能及多尺度结构的影响规律，获得了原花青素复合对发酵大米淀粉多尺度结构和消化性能转变的影响机制。结果表明，发酵大米淀粉经不同添加量的原花青素复合后，发酵大米淀粉-原花青素复合物的RDS和SDS含量随原花青素含量的增加逐步降低，而RS含量则显著增加。而发酵大米淀粉-原花青素复合物抗消化性能提高的原因一方面是原花青素与淀粉分子通过非共价相互作用使得短程有序结构及单螺旋结构比例增加，A型结晶结构比例、双螺旋结构比例及无定型厚度降低。另一方面，在消化过程中无定形区域的部分原花青素可解离为酶抑制剂，协同提高淀粉的抗消化性能。通过对原花青素与发酵大米淀粉的多尺度结构和消化性能变化规律的系统探究可为发酵米制品的营养功能调控及提升和功能米制品的深加工提供依据。