黄芩苷的生物学功能及在奶牛上的应用研究进展

聂德超 张 卓 赵 琛 李艳玲

(北京农学院动物科学技术学院，北京 102206)

黄芩苷(baicalin)又名贝加灵、黄芩甙，属葡萄糖醛酸苷类，分布于黄芩(ScutellariabaicalensisGeorgi)的根茎叶中，是黄芩中含量最丰富的黄酮类化合物之一[1-2]。随着对黄芩有效成分的深入研究，黄芩中的活性物质被广泛认知，谱效关系显示黄芩苷在黄芩发挥生物学功能的过程中具有重要的作用[3-4]。研究表明，黄芩苷具有抗菌、抗炎、抗氧化应激和调节机体免疫等生物学功能[5]。在当今全面禁抗的大背景下，绿色健康养殖受到人们广泛关注，植物提取物作为新型饲料添加剂替代抗生素，具有预防动物疾病发生、促进动物健康生长的潜力，逐渐成为研究热点[6]。对黄芩苷的深入研究与应用，将对畜牧养殖的健康发展具有重要意义。本文就黄芩苷的理化性质与代谢特点、生物学功能及其在奶牛生产上的应用进行了阐述，以期为其在奶牛生产中的开发利用提供新的思路和指导。

1 黄芩苷的理化性质与消化代谢特点

黄芩苷化学名称为5,6-二羟基-7-O-葡萄糖醛酸苷黄酮(化学式为C21H18O11)，结构式如图1所示，为淡黄色细针晶，熔点223 ℃，相对分子质量为446.36，易溶于N,N-二甲基甲酰胺、吡啶，不溶于水、乙醚、苯和氯仿等[7-8]。常见的黄芩苷提取方法有水提法、醇回流法、超声法和微波提取法等，不同的提取方法对黄芩苷的提取率有显著影响，同时对其活性也有一定的影响[9-11]。王仁广等[12]以水为提取溶剂，采用Box-Behnken试验设计优化提取工艺，得到最佳提取工艺条件为物料粒度过100目筛，提取时间2.41 min，液料比33 mL/g，此条件高速高效、绿色环保，且黄芩苷提取率可达12.21%。另有研究表明，当料液比为1∶18、乙醇浓度为55%、pH为4.0、超声功率为59 kHz时，黄芩苷的提取率可达到16.52%[13]。随着科技的发展，黄芩苷的提取技术也在不断发展，其提取纯度和提取率不断提高。传统的水提法和醇回流提取法具有工艺简单、操作简便和提取成本低廉等优点，便于大规模工业生产。超声法和微波提取法因其自身特点目前只限于实验室操作。因此，寻求和探索一种高效、简洁、方便的黄芩苷提取技术也是未来主要研究方向。

图1 黄芩苷的结构式Fig.1 Structural formula of baicalin

黄芩苷具有较强的极性，故其不能通过被动运输通过细胞膜，需要在多耐药相关蛋白(MRP)2和乳腺癌耐药蛋白(BCRP)等转运蛋白的作用下进入细胞内[14]。黄芩苷主要在肝脏和肠道中进行代谢，在肝脏中代谢途径主要为羟基化、脱羟基化、甲基化和脱葡萄糖醛酸化；在肠道中黄芩苷经脱糖反应生成黄芩素，再经羟基化、脱羟基化、甲基化进行代谢反应[15]，其在肝脏和肠道中的代谢途径与产物分别如图2和图3所示。Huang等[16]研究发现，黄芩苷在血液中经β-葡萄糖醛酸酶、葡萄糖醛酸转移酶、硫酸酯酶和儿茶酚氧位甲基转移酶等酶的作用进一步代谢，代谢物经血液运输到达肝脏、肾脏和脾脏等部位。Zhang等[17]在大鼠中鉴定出黄芩苷的代谢产物有32种，其中尿液中检测到23种，血浆中检测到26种，肾脏和肝脏含有的黄芩苷代谢物最多，分别有10种和9种，而在心脏、脾脏、肺脏和脑中仅观察到5种代谢物，这也表明黄芩苷代谢的主要器官在肝脏。Zhang等[18]研究发现，黄芩苷在消化道内很难被吸收，但容易被肠道细菌产生的β-葡萄糖醛酸酶水解为容易吸收进入血液的黄芩素，黄芩素进入血液后可在体循环中被尿苷二磷酸-葡萄糖醛酸转移酶还原为黄芩苷。黄芩苷进入肠道后先在小肠上段吸收，随后以苷元的形式在结肠被吸收，经一系列代谢反应后最终在MRP2的作用下以葡萄糖醛酸苷的形式在胆汁中排泄[19]。黄芩苷与黄芩素在体内相互转化共同发挥抗炎、抗氧化等生物学功能[20]。

图2 黄芩苷在肝脏中的代谢途径与产物Fig.2 Metabolic pathway and products of baicalin in liver[15]

图3 黄芩苷在肠道中的代谢途径与产物Fig.3 Metabolic pathway and products of baicalin in intestine[15]

2 黄芩苷的生物学功能及其作用机制

2.1 抗菌

黄芩苷具有显著的抗菌作用，其生物抑菌机制包括破坏细菌细胞膜、抑制细菌的脱氧核糖核酸、抑制菌蛋白质生物合成和降解内毒素等，对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念球菌等有害菌具有显著的抑制作用[21]。黄芩苷结构中的羟基在抗菌作用中发挥着显著作用[22]。研究表明，黄芩苷可以阻止金黄色葡萄球菌对细胞黏附，并直接结合到金黄色葡萄球菌的活性部位，以阻断与其底物的结合，导致金黄色葡萄球菌的活性降低，达到抑菌作用[23]。Zhao等[24]研究发现，黄芩苷通过改变乳房炎病原菌大肠杆菌的细胞膜通透性，使细菌表面凹陷、皱缩发生形变，降低细菌体内耐药基因的表达，达到抗菌作用。在白色念珠菌生物膜体外抗真菌活性的研究中发现，黄芩苷能抑制琥珀酸脱氢酶活性，增加细胞内钙离子含量，加速细胞凋亡，并伴有明显的超微结构改变，调控生物膜的通透性以达到抗菌作用[25]。黄芩苷代谢产物黄芩素和木蝴蝶素具有抑制侵袭能力、生成硝酸盐、转录表达炎症反应的相关毒力基因的作用，通过调节宿主反应和病原体毒力来保护机体免受细菌感染[26]。Zhang等[27]研究表明，黄芩苷可以通过抑制群体感应系统来调节金黄色葡萄球菌的感染，抑制金黄色葡萄球菌毒力相关因子α溶血素(hla)和argA的表达，使细菌细胞壁明显折叠，部分细胞壁裂开，胞内物质渗出，细菌毒性降低。通过以上研究结果分析得出，黄芩苷的抑菌效果非常明显，但对黄芩苷化学结构与菌体细胞结构结合的机理，还有待进一步的研究。

2.2 抗炎

黄芩苷结构中Δ2平面的双键结构在抗炎反应中发挥着重要作用，其可以作用于环氧化酶起到抗炎效果，同时其结构中的自由酚羟基和羰基也具有一定的抗炎作用[28]。黄芩苷可以通过抑制炎性因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-17(IL-17)、基质金属蛋白酶-9和调节核因子-κB(NF-κB)信号通路等发挥抗炎作用[29]。Cheng等[30]研究表明，脂多糖(LPS)能够通过激活Toll样受体4(TLR4)引起细胞损伤，将炎症因子NF-κB转移到细胞核中并改变相关炎症基因的表达。黄芩苷一方面可以显著降低诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和环氧化酶-2(COX-2)的基因表达发挥抗炎功能，另一方面可以通过下调细胞中磷酸核因子NF-κBp65和磷酸NF-κB抑制激酶的表达来抑制LPS诱导的TNF-α、IL-6和白细胞介素-8(IL-8)的产生，并以剂量依赖的方式减轻炎症细胞浸润、充血和上皮细胞脱落等[31-32]。Ye等[33]研究表明，50～100 mg/mL的黄芩苷能显著抑制LPS诱导的仔猪单核吞噬细胞产生TNF-α、白细胞介素-18(IL-18)及IL-1β，其发挥抗炎活性与抑制LPS刺激下的含有3的Nod样受体家族pyrin结构域(NLRP3)炎症体通路相关，但具体信号通路还有待探究。以上研究表明，黄芩苷可通过多种代谢通路发挥抗炎作用，但如果对这些代谢通路进行调控，更好地发挥黄芩苷的抗炎功能，还需进一步的研究。由细菌、病毒等病原体感染引起的炎症反应会破坏机体的自由基稳态，从而产生活性氧(ROS)和活性氮(RNS)，进一步参与病原体的复制、基因突变并诱发宿主细胞凋亡，从而促使炎症进一步发生。自由基导致的氧化应激与炎症和免疫失衡通过调控转录水平进而相互影响，形成由自由基稳态失衡主导产生的三方联动效应[34]。动物许多疾病产生深层次营养代谢根本原因是机体内部自由基稳态失衡引起的氧化应激，氧化应激和炎症通常是畜群出现的健康问题2个重要引爆点，其中由自由基稳态失衡造成的氧化应激是源头引爆点。炎症是这一联动效应中重要的一方。氧化应激加重炎症反应，而炎症通过炎症介质促进氧化，反过来又加重氧化应激，形成恶性联动循环。

2.3 抗氧化应激

黄芩苷具有清除超氧自由基、抑制脂质过氧化和提高抗氧化酶活性的能力，具有保护生物膜和延缓衰老的作用，其发挥抗氧化活性是黄芩苷结构中6-酚羟基基团起主要作用，6-酚羟基易断裂发生抽氢反应进而发挥抗氧化作用[35-36]。Guo等[37]研究表明，在小鼠模型中热休克蛋白(Hsp)是一种应激反应蛋白，黄芩苷可以通过Fas/Fas配体途径和调节Hsp7家族基因在支持细胞中的表达并改善干细胞因子(SCF)和胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)的表达来阻止热应激诱导的细胞凋亡，达到抗氧化应激的目的。吴宜艳等[38]研究表明，50～100 μmol/L的黄芩苷可以通过调节硫氧还蛋白(Trx)氧化还原系统和细胞凋亡途径，提高超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性，降低丙二醛(MDA)含量，进而发挥对细胞的保护作用。黄芩苷可以逆转应激引起的细胞损伤，其通过降低MDA和4-羟基醛(4-HNE)含量，抑制内源性ROS的产生，提高线粒体乙醛脱氢酶2(ALDH2)的mRNA表达和蛋白水平及ALDH2活性，具有显著的抗氧化作用[39]。Qian等[40]研究表明，黄芩苷具有清除自由基和减少脂质过氧化的能力，可以显著提高动物体内SOD和GSH-Px活性，降低MDA含量，下调蛋白激酶D1和NF-κB蛋白表达从而发挥缓解氧化应激的作用。

2.4 免疫调节

黄芩苷对动物机体免疫器官和组织具有调节和保护作用。Toll样受体(TLRs)可启动宿主免疫反应，黄芩苷对TLR4信号通路的阻断始于对其内源性配体高迁移率族蛋白B1(HMGB1)的抑制作用，其通过调节NF-κB和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)[p38、细胞外信号调节激酶(ERK)和c-Jun氨基末端激酶(JNK)]，以及它们各自的靶分子，促炎细胞因子或激活蛋白-1(AP-1)产生从而达到调节免疫的作用[41]。马雁南等[42]研究黄芩苷对小鼠子宫局部免疫调节作用时发现，0.4 mL/(mg·d)的黄芩苷在小鼠子宫局部免疫调节中，可通过促进Th2型途径安胎作用，抑制Th1型免疫细胞产生TNF-α，在避免胚胎丢失方面发挥作用。黄芩苷可提高动物吞噬细胞的吞噬指数，促进T、B淋巴细胞增殖，从而增强机体抗微生物感染能力。Gong等[43]研究发现，100 μg/mL黄芩苷可以通过增加白细胞介素-2(IL-2)mRNA的表达刺激T、B细胞增殖，参与先天性和适应性免疫反应，从而增强机体抗微生物感染能力，同时可以通过上调T、B淋巴细胞中TLR3、TLR7、TLR8和TLR9基因的表达来提高免疫调节作用。在动物体内，巨噬细胞对清除凋亡细胞、维持组织稳态、保护免疫应答方面起核心作用，黄芩苷通过上调M2D型巨噬细胞特征因子血管内皮生长因子以及显著上调MER原癌基因酪氨酸蛋白激酶(MERTK)和正五聚蛋白3(PTX3)等基因的表达，促进M2C型巨噬细胞极化，提高机体免疫能力[44]。

黄芩苷还可以通过靶向凋亡途径、MAPK途径、磷脂酰肌醇-3-羟激酶(PI3K)-Akt-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路和肿瘤相关巨噬细胞来抑制肿瘤生长，对肿瘤生长具有显著的抑制作用[45-46]。不同浓度的黄芩苷处理人骨肉瘤细胞后，线粒体膜电位明显下降，ROS产生，激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)-9和caspase-3，并以剂量和时间依赖的方式降低宿主细胞的生存能力，以及通过活性氧诱导细胞凋亡[47]。黄芩苷可以激活MAPK途径，通过积累ROS、激活p38抑制剂和增强肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)的抗癌活性，进而达到抗癌的目的[48]。Diao等[49]研究表明，黄芩苷可以抑制剂的方式下调肿瘤组织中PDZ结合激酶(PBK)/托普卡下游信号分子组蛋白H3和ERK2的表达，抑制肺癌细胞增长。同时，黄芩苷也可以上调孕酮诱导的蜕膜蛋白(DEPP)，激活体内Ras/Raf/丝裂原活化蛋白激酶激酶(MEK)/ERK信号通路，调节肿瘤细胞中衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)的活性，提高体内SOD活性，降低ROS水平，诱导肿瘤细胞衰老[50]。当机体发生免疫应激时，体内抗氧化系统随之也会失衡从而激活氧化应激系统，其中NF-κB信号通路是连接这2个系统的桥梁。LPS在激活NF-κB信号通路的同时会释放大量ROS，抑制或减少细胞的氧化损伤，增强细胞的抗氧化能力。

3 黄芩苷在奶牛生产中的应用

3.1 提高奶牛的抗热应激能力

将黄芩苷作为饲料添加剂添加到饲粮中可有效缓解奶牛的热应激。当动物暴露于高温的时候，机体就会由于热应激合成Hsp70，来保护动物体自身。焦玉兰[51]研究复合黄芩苷制剂治疗奶牛热应激时发现，添加黄芩苷治疗可以提高机体Hsp70水平，从而使机体更早更快地适应热应激状态，更好地保护机体器官免受热应激的损伤。在热应激状态下，动物机体的甲状腺活动减弱、代谢降低，导致甲状腺激素和三碘甲腺原氨酸的分泌量减少；皮质醇的重要作用是提高机体抵抗力，增强体液免疫，进而提高动物对热应激的适应性。研究发现，黄芩添加剂组中奶牛血液中的皮质醇、甲状腺素和三碘甲腺原氨酸分别比对照组提高24.71%、3.25%和27.78%，这说明黄芩添加剂具有预防和减轻奶牛热应激的作用[52]。国晓瞳等[53]研究表明，黄芩苷通过提高热应激下睾丸支持细胞表达胶质细胞源性神经生长因子和干细胞因子的表达，保护热应激导致的牛睾丸支持细胞的损伤。以上研究表明，黄芩苷添加剂可通过提高血液生化指标和Hsp的水平，使机体提早适应热应激更好地保护机体免受热应激损害。

3.2 治疗奶牛的乳房炎

奶牛乳房炎是机体代谢和生理状态改变，乳房损伤以及接触传染性病原微生物等引起的乳腺炎症反应。黄芩苷被广泛用于中药配伍治疗奶牛乳房炎。芩红灌注剂是治疗奶牛乳房炎的一种中药混合物，芩红灌注剂中的黄芩苷可以用来作为该药药效的质量评价标准[54]。同时，高翔[55]的研究也表明，黄芩苷可以作为中药灌注剂的主要成分来治疗奶牛乳房炎。此外，黄芩苷可以降低血管通透性，通过抑制释放组胺、白细胞介素以及5-羟色胺等介质，减轻细胞损伤，起到抗炎的作用，当发生急性炎症时，它能明显减少炎症介质的含量，对治疗奶牛乳房炎具有明显作用[56]。

乳腺上皮细胞是构成乳腺组织的主要组成细胞，在乳腺的发育、退化、泌乳及炎症的发生中起着重要的作用。Perruchot等[57]研究表明，1～10 μg/mL的黄芩苷能减弱H2O2诱导的活性氧产生，并显著提高过氧化氢酶活性和核因子E2相关因子2(Nrf2)蛋白表达，通过调节细胞增殖、凋亡、细胞活力和氧化反应促进奶牛乳腺上皮细胞的发育。同样，黄芩苷可以抑制LPS诱导的TNF-α和IL-1β细胞因子的产生和基因表达，阻止NF-κB的活化，增加Hsp72的表达，以保护奶牛乳腺上皮细胞免受LPS诱导的炎症和凋亡，从而提高细胞活力[58]。在金黄色葡萄球菌诱导的奶牛乳腺上皮细胞凋亡和坏死过程中，黄芩苷可抑制金黄色葡萄球菌产生潘顿-瓦伦丁白细胞介素(PVL)和重组PVL 2种毒素，降低金黄色葡萄球菌中LukS-PV蛋白表达水平，揭示了黄芩苷对PVL毒素引起的奶牛乳房炎具有治疗作用[59]。马维武[60]研究表明，高浓度的黄芩苷(大于25 μg/mL)具有一定的细胞毒性，低浓度的黄芩苷(2.5～10.0 μg/mL)可以缓解金黄色葡萄球菌诱导的奶牛乳腺上皮细胞损伤。以上研究结果表明，黄芩苷可通过减轻细胞损伤、减少炎症介质含量和抑制金黄色葡萄球菌的活性，从而达到预防和治疗奶牛乳房炎的效果。

3.3 提高奶牛的泌乳性能

将黄芩作为饲料添加剂添加到饲粮中可以提高奶牛的泌乳性能。火东晓等[61]研究黄芩添加剂对泌乳奶牛泌乳性能的影响，结果表明，添加含黄芩的中草药组奶牛的脉搏数较对照组显著降低，产奶量提高了15.67%，说明黄芩添加剂可有效缓解热应激对奶牛的不良影响。胡美华[62]研究发现，将含黄芩的中草药添加到饲粮中，结果表明，试验组比对照组平均每头牛每日多产奶1.08 kg，比对照组提高了8.81%，且试验组的各种乳成分含量明显提高，其中乳蛋白、总固形物、非脂固形物含量均显著增加；试验组的乳脂率和乳蛋白比对照组分别提高6.32%和16.61%。赖雨宏等[63]研究山花黄芩提取物对奶牛生产性能、乳品质及经济效益的影响时发现，在饲粮中添加10、20、40 g/d的山花黄芩提取物，奶牛平均产奶量分别比对照组提高18.7%、28.7%、31.8%，乳蛋白率分别提高4.2%、13.5%、18.5%，该试验结果表明，山花黄芩提取物可有效提高奶牛产奶量和乳品质。另外，用复合黄芩苷制剂治疗奶牛，与热应激组相比，平均日产奶量可提高4.6%，乳脂率提高0.8%，乳蛋白率提高1.0%[51]。由此可见，复合黄芩苷具有提高奶牛产奶量和乳品质的作用。因此，在奶牛饲粮中添加适量的黄芩苷可有效提高奶牛泌乳性能，同时改善乳品质。

4 小 结

黄芩苷作为黄芩的主要提取物，具有抗菌、抗炎和抗氧化应激等生物学功能，在奶牛生产中具有很好的应用前景。它既可以作为活性饲料添加剂，提高奶牛的抗应激能力和泌乳性能，也可以作为复方中草药用来治疗奶牛疾病，总体提高动物的生产性能和抗病力，从而提高养殖场的总体经济效益。然而，黄芩苷在奶牛体内如何代谢以及其调控机理还有待进一步研究，因此需要加强黄芩苷在奶牛生产中的应用效果及其作用机制研究，为进一步开发黄芩苷作为生物活性物质在奶牛中的应用提供理论依据。