加味阳和汤对阳虚寒凝型酒精性股骨头坏死大鼠PI3K、AKT基因及蛋白表达水平的影响

谭婕，李芃，王洪星

股骨头坏死又称股骨头缺血性坏死，因多种因素导致股骨头缺血障碍，从而导致软骨下区的软骨细胞和骨细胞得不到所需的营养物质而坏死，并伴随局部骨质疏松，最终因外力作用或者意外伤导致股骨头塌陷[1]。股骨头坏死病因复杂，治疗困难，严重影响患者日常生活，是成年人致残的重要原因之一。关于股骨头坏死的保髋治疗方案，药物治疗非常广泛，但目前没有一种药物治疗方案疗效显著[2]，查阅过去报道来看，二膦酸盐类(如阿仑膦酸钠)能有效调节破骨细胞功能、阿托伐他汀药物能有效调节脂类代谢异常、肝素能有效调节凝血功能、维生素E参与氧化应激类药物、1,25-(OH)-D3和维生素K等参与骨代谢，均对股骨头坏死有防治作用[3-4]，中药对股骨头坏死的治疗作用也日益受到重视[5-7]。基于生物学及基因研究证实，PI3K、AKT信号通路可对血管修复再生、成骨细胞分化增殖凋亡与破骨细胞分化相关因素进行有效调控。因此通过检测PI3K、AKT基因表达水平以及蛋白表达水平，可对药物的有效性进行量化评估。现观察加味阳和汤对阳虚寒凝型酒精性股骨头坏死大鼠PI3K、AKT基因及蛋白表达水平的影响，报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 实验动物：健康8周龄雄性Wistar大鼠33只，体质量为(290±20)g，由吴氏动物提供，全部大鼠采用标准饲料高笼饲养，自由饮水，适应性喂养1周。实行12 h/12 h间断照明。室温控制在(24±2)℃。试剂与药品：中药汤剂由福州市中医院煎药房制备，药物浓度1 g/ml。复方骨肽注射液(南京新百药业有限公司生产，国药准字H32020004，规格：5 ml∶75 mg/瓶)。

1.2 实验方法

1.2.1 模型制备 阳虚寒凝型酒精性股骨头坏死模型建立：采用冷固法复合酒精灌胃复制阳虚寒凝型酒精性股骨头坏死模型。造模第1周。采用含体积分数46%酒精灌胃[8]，灌胃量约10 ml·kg-1·d-1，造模周期24周(相当于正常成年人每日饮酒500～800 ml，连续饮用10余年)；同时，每日8:00将大鼠放入没过大鼠髋关节的(6±0.5)℃的冰水6 h。6 h后，固定大鼠双下肢，至次日8:00，如此反复。24周时，随机处死9只大鼠，观察股骨头形态、滑膜，计算空骨陷窝百分比[9]，判定股骨头坏死模型建模成功，开始分组给药。

1.2.2 分组 建模成功后，将24只大鼠随机分为空白对照组、治疗组1、治疗组2，每组8只。

1.2.3 给药方法 根据《医学实验动物学》实验动物用药剂量换算原则，大鼠给药剂量(mg/kg)=6.25×人服药剂量(mg/kg)。治疗组1予复方骨肽注射液肌肉注射，14.38 mg/kg，1次/d，连续治疗4周。治疗组2予加味阳和汤灌胃[组方：熟地30 g，鹿角胶6 g，姜炭2 g，肉桂(去皮，研粉)3 g，白芥子6 g，麻黄2 g，生甘草3 g，土鳖虫10 g、蜂房5 g、续断10 g、骨碎补10 g]，2次/d，水煎煮，灌胃给药，持续治疗4周。空白对照组仅予以0.9%氯化钠溶液，持续4周，

1.3 观察指标与方法 治疗后通过RT-PCR及Western-Blotting检测PI3K、AKT基因及蛋白表达水平。比较3组PI3K、AKT基因及蛋白表达水平。(1)RT-PCR检测：选择美国ABI公司生产的7500型荧光定量PCR仪进行检测，选取20 μl作为研究的扩增体系，试验相关条件即为：在95 ℃下进行5 min 1次的循环；95 ℃、20 s，60 ℃、40 s，进行40次循环；从65～95 ℃以0.5 ℃进行递增。依据2-ΔΔCT计算PI3K、AKT基因相对表达量，每组有3个复孔开展3次重复试验。(2)Western-Blotting检测：以常规方法对总蛋白进行提取，于-80 ℃冰箱中进行存储。选取总蛋白样本实施SDS-PAGE凝胶电泳处理，在冰浴下通过80 V电压转到PVDF膜，经1.5 h处理。在通过PBST缓冲液进行3次洗膜后实施1.5 h封闭。完成剪膜加入一抗以4 ℃下进行孵育过夜，大鼠抗人PI3K抗体、大鼠抗人AKT抗体的稀释比例均为1∶1 000。第2日复温，通过PBST摇摆进行3次清洗后进行二抗，于室内温度下进行60 min孵育，收集条带结果通过凝胶成像分析，以Image J软件实施量化分析。

2 结 果

2.1 PI3K、AKT基因表达水平 PI3K、AKT基因表达水平空白对照组低于治疗组1低于治疗组2(P<0.05)，见表1。

表1 3组大鼠PI3K、AKT基因表达水平比较

2.2 PI3K、AKT蛋白表达水平 PI3K、AKT蛋白表达水平空白对照组低于治疗组1低于治疗组2(P<0.05)，见表2、图1。

表2 3组大鼠PI3K、AKT蛋白表达水平比较

图1 3组大鼠PI3K、AKT通路对应蛋白表达水平印迹图

3 讨 论

研究证实，PI3K、AKT信号通路可对血管再生及修复中的关键因素进行调控[10]，如血管生成素、血管内皮生长因子、一氧化氮、缺氧诱导因子等。PI3K、AKT信号的增强可以调控Wnt/β-catenin通路、骨形态发生蛋白与叉头框转录因子O信号通路[11-16]，从而影响成骨细胞的分化凋亡，引起成骨细胞增殖、延缓其凋亡时间[17]。PI3K、AKT可对RANKL通路、肿瘤坏死因子α、microRNA/P ten通路进行调控，通过抑制破骨细胞增殖来维持骨代谢平衡[18-20]。所以，通过检测PI3K、AKT基因的表达强度，能够对药物或治疗方案的有效性进行量化评估。

在长期的临床观察中发现，阳虚寒凝型股骨头坏死主要表现为髋关节疼痛、拘挛、屈伸不利或伴有下肢沉重、肢体麻木等，根据“寒为阴邪、损伤阳气”“寒性凝滞、寒主收引”“寒凝血瘀、不通则痛”观点，其致病乃“风、寒、湿三气杂至，合而为痹”。正如《内经》所云:“恶血在内而不去，卒然喜怒不节，饮食不适，寒温不时，腠理闭而不通，其开而遇风寒，则气血凝结，外邪相袭，则为痹痛”。根据上述机制，中药治疗阳虚寒凝型酒精性股骨头坏死，当着眼于温阳、散寒、活血、通络、祛湿等。大量文献表明，温阳散寒、活血祛湿、舒筋止痛类中药在血管内皮生长因子、骨形态发生蛋白、转化生长因子β等因素上均有明确效应[15-18]。

本研究应用的加味阳和汤在原方熟地30 g，鹿角胶6 g，姜炭2 g，肉桂(去皮，研粉)3 g，白芥子6 g，麻黄2 g，生甘草3 g的基础上，添加土鳖虫10 g、蜂房5 g、续断10 g、骨碎补10 g，加强活血祛湿通络功效。方中以熟地、鹿角胶为君药，滋补阴血、填精益髓、补肾助阳，借助血肉有情之物，补益精元，使阳气生化有源，此为“阴中求阳”之法。臣药为肉桂、姜炭，温阳散寒通脉。因寒凝湿滞，非温通不足以化。佐药为麻黄、白芥子，开腠理、祛痰湿，以宣散体表之寒凝，且宣通气血。又令熟地黄、鹿角胶共为佐药，补而不滞。生甘草为使药，解毒、调和诸药。配合药对蜂房、土鳖温肾通络，续断、骨碎补强筋壮骨。纵观全方，温阳药与补阴药合用，辛散药与滋补药配伍，活血通络、健脾祛湿，使寒湿得宣而不伤正，精血得充而不恋邪，可化阴凝而布阳和。在临床的观察中，通过口服中药，配合保护性负重及针对性关节锻炼，可以有效缓解患髋疼痛、屈伸受限及下肢酸楚无力等问题。但对于评估是否能有效延缓病程，仍缺乏量化指标及长期跟踪随访。

本实验采用加味阳和汤治疗阳虚寒凝型酒精性股骨头坏死大鼠，通过对3组大鼠给药后PI3K、AKT基因表达水平以及蛋白表达水平进行检测发现，治疗组PI3K、AKT基因表达水平以及蛋白表达水平均优于空白对照组，且治疗组2较治疗组1各指标改善更显著，表明加味阳和汤可调控PI3K、AKT基因及蛋白表达水平。但由于PI3K、AKT可通过调控糖原合成激酶3β发挥作用，且糖原合成激酶3β磷酸化表达水平并不是越高越有利于成骨细胞分化[1]。有研究证实高水平的糖原合成激酶3β会抑制干细胞在股骨头坏死中的分化，并造成β-catenin减少，并且在大鼠关节炎模型的建立中发现，过多糖原合成激酶3β磷酸化表达可加快成骨细胞的凋亡[9]。因此PI3K、AKT在自身促进成骨细胞增殖的同时，也可通过糖原合成激酶3β实现与Wnt/β-catenin的链接从而加强成骨细胞的分化增殖，但需对把控糖原合成激酶3β磷酸化含量引起重视。关于此方面的研究，目前尚缺乏有价值的数据进行评估判定，关于PI3K、AKT表达水平的拐点如何测定，将在后期的实验中进一步观察。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突。