Exocyst复合物关键亚基Sec3蛋白在气道黏液高分泌中的作用研究*

王 齐，周向东△，李 琪，钟有清，王远礼，胡基杨

海南医学院第一附属医院：1.呼吸内科；2.检验科，海南海口 570102

气道黏液高分泌为慢性气道炎性疾病的重要病理特征，且长期气道黏液高分泌状态可引起黏液-纤毛清除功能障碍、肺功能进行性下降，最终导致病情恶化甚至死亡[1]。黏蛋白是一类具有形成凝胶能力的糖蛋白，其中气道黏蛋白5AC(MUC5AC)主要分布于气道，参与气道黏液形成[2]。已有研究表明，MUC5AC过度生成和分泌是导致气道黏液高分泌的重要原因之一[3]。另有研究指出，炎症介质、香烟烟雾、冷空气刺激等因素可增加MUC5AC的合成，同时亦可促进其胞外极向分泌[4]。因此猜想，气道黏液高分泌与MUC5AC的病理性胞外分泌有关。Exocyst复合物是介导细胞内蛋白极性胞外分泌的关键因子，广泛分布于组织和器官中，其中Sec3稳定定位于分泌活跃区细胞质膜上，常作为细胞分泌位点空间标志物[5]。患者气道有慢性炎症时，气道上皮杯状细胞数量及MUC5AC水平明显高于健康人群，变应原等刺激引发急性发作时，胞质中MUC5AC储备量无法在短时间内进一步升高[6]。故猜想，急性发作引发的气道黏液高分泌可能与胞内分泌活跃区极性诱导MUC5AC出胞有关。人中性粒细胞弹性蛋白酶(HNE)为目前已知的促气道黏液分泌因子[7]。本研究采用香烟烟雾暴露法建立慢性支气管炎症的病理性改变，然后利用HNE攻击，从而形成气道黏液高分泌大鼠模型，同时以人正常支气管上皮细胞作为细胞模型，探讨了Exocyst复合物关键亚基Sec3蛋白在气道黏液高分泌形成过程中的作用及机制，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1实验动物与细胞 SD大鼠60只，SPF级，成年雄性，体质量250～300 g，购自河南省实验动物中心，许可证号SCXK(豫)2017-0001。人支气管上皮细胞(16HBE)购自武汉普诺赛生命科技有限公司，货号CL-0249。

1.2仪器与试剂 RPMI-1640培养基(货号PM150110)购自武汉普诺赛生命科技有限公司；玉溪牌香烟，焦油量12 mg，含尼古丁1.2 mg，含CO 12 mg，购自红塔烟草集团有限责任公司；HNE(货号4716)购自上海齐一生物科技有限公司；糖原过碘酸-雪夫氏(PSA)染色试剂盒(货号G1281)、总RNA提取试剂盒(货号R1200)、HRP标记山羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G抗体(货号SE134)均购自北京索莱宝科技有限公司；兔抗MUC5AC单克隆抗体(货号ab198294)、鼠抗β-actin单克隆抗体(货号ab8226)均购自美国Abcam公司；DAB显色试剂盒(货号AR1022)购自武汉博士德生物工程有限公司；鼠抗Sec3单克隆抗体(货号sc73353)购自美国Santa Cruz公司；反转录试剂盒(货号205111)购自上海玉博生物科技有限公司；One-Step SYBR实时荧光定量PCR(RT-PCR)试剂盒(货号QPG-20)购自北京世联博研科技有限公司；ECL发光液(货号WBKIS0100)购自上海利翰生物科技有限公司。

1.3方法

1.3.1气道黏液高分泌大鼠模型构建 采用香烟烟雾暴露法建立慢性支气管炎症的病理性改变，HNE攻击形成慢性气道炎症急性发作。适应性饲养大鼠1周后，将大鼠随机分为正常对照组、烟雾暴露组、烟雾暴露+HNE组，每组各20只；置于40 cm×30 cm×20 cm有机玻璃箱，箱顶部和四周各有5个圆形通气孔，直径为2 cm；点燃香烟后放入玻璃箱，每次5支，每天2次，持续12周；实验前3 d烟雾暴露+HNE组给予香烟烟雾刺激的同时给予HNE冲击，生理盐水配置为100 U/mL溶液，以超声雾化器雾化吸入，每次1 h，每天1次，诱导急性发作。

1.3.2PAS染色 麻醉大鼠后，经肺门至肺边缘进行横切，取支气管肺组织，长约2～3 mm，4%多聚甲醛固定48 h；常规脱水、透明、浸蜡，石蜡包埋，制备厚度5 μm切片；按照糖原PSA染色试剂盒说明书操作，400倍下显微镜观察染色情况，随机选取直径在500～1 000 μm的支气管腔区域，测量玫红色染色面积，以其占该区域总面积比例反映气道上皮杯状细胞增生程度；Image ProPlus软件计算选定区域积分吸光度值，反映黏液分泌量。

1.3.3免疫组织化学(IHC)染色 取肺组织石蜡切片，脱蜡、水化后，滴加一抗，4 ℃过夜孵育；PBS缓冲液清洗，每次5 min，共3次；滴加生物素标记二抗，37 ℃孵育30 min；PBS缓冲液清洗，每次5 min，共3次；DAB显色，苏木素复染，常规脱水、透明，中性树胶封片；显微镜下观察染色情况，以气道上皮细胞膜或细胞质棕黄色或棕褐色颗粒为阳性染色，随机选取6个视野，Motic Fluo软件定量分析，测定吸光度值，反映蛋白相对表达水平。

1.3.4细胞培养及处理 细胞置于含10%胎牛血清和1%青霉素的RPMI-1640培养基中，置于37 ℃、5%CO2培养箱内培养，每天更换1次培养液；细胞密度达80%时进行传代，随机分为16HBE组和16HBE+HNE组；取对数生长期细胞，16HBE+HNE组给予HNE(1 000 ng/mL)处理24 h，16HBE组以等体积DMEM培养基处理，再次置于37 ℃、5%CO2培养箱内培养。

1.3.5细胞转染 将细胞分为16HBE+HNE组、空质粒转染组和sh-Sec3组，由上海生工生物工程有限公司设计并合成sh-Sec3和无义序列，上游序列：5′-GATCCAGTGTAATCGGTACAT-3′，下游序列：5′-ACGTTAAAGTGGTACATGATT-3′；将sh-Sec3和对照shRNA分别加入Lipofectamine 2000溶液，每组设置6个复孔；72 h后收集细胞，检测Sec3蛋白及mRNA相对表达水平。

1.3.6蛋白免疫印迹实验 取对数生长期细胞，收集于离心管内，预冷RIPA裂解液，反应1～2 s；4 ℃离心15 min，取上清液；琼脂糖凝胶电泳分离蛋白，湿法转至聚偏二氟乙烯膜；膜封闭液反应1 h，分别加入Sec3、p-Sec3、MUC5AC抗体，稀释比例为1∶500，β-actin抗体，稀释比例为1∶1 000，室温孵育2 h；PBS缓冲液清洗3次，每次5 min；滴加HRP标记山羊抗兔IgG抗体，稀释比例1∶1 000，室温孵育2 h；采用ECL发光液，暗室曝光，拍照保存，Image J软件进行半定量分析。

1.3.7RT-PCR 取对数生长期细胞，提取细胞总RNA，定量和纯化后，反转录为cDNA；按照One-Step SYBR RT-PCR试剂盒说明书操作，进行PCR扩增。Sec3上游引物：5′-CCAACCGTTGAGGCCACCA-3′；下游引物：5′-CCTAGTGGAACGTGGCACT-3′。MUC5AC上游引物：5′-ATGACCCTGGTACACACCC-3′；下游引物：5′-CGTACGTTTACAAACCCTG-3′。GAPDH为内参，上游引物：5′-GATGCGTGTGCTGAG TATG-3′；下游引物：5′-CAGTCATGGGTAACCATGC-3′；采用2-ΔΔCt法计算Sec3和MUC5AC的mRNA相对表达水平，实验重复3次。

1.3.8免疫共沉淀 取对数生长期细胞，加入RIPA溶液，冰上裂解30 min；滴加Sec3抗体，4 ℃摇床过夜；以10∶1比例将蛋白样品和50%琼脂糖蛋白A混匀，4 ℃摇床10 min；混合液中滴加Sec3抗体，4 ℃摇床孵育2～4 h；4 ℃下3 000 r/min离心3 min，弃上清液；裂解缓冲液冲洗3次，每次5 min；加入2×SDS上样缓冲液，沸水浴煮沸5 min；同步骤选用MUC5AC抗体，最终进行蛋白免疫印迹试验，分析Sec3与MUC5AC的相互作用。

2 结 果

2.13组大鼠气道上皮杯状细胞增生及黏液分泌比较 与正常对照组比较，烟雾暴露组和烟雾暴露+HNE组大鼠气道上皮杯状细胞增生，黏液分泌量增加，且烟雾暴露+HNE组变化更明显；与烟雾暴露组比较，烟雾暴露+HNE组大鼠气道上皮杯状细胞增生，黏液分泌量增加，组间比较差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1、图1。

表1 3组大鼠气道上皮杯状细胞增生及黏液分泌量比较

注：A为正常对照组；B为烟雾暴露组；C为烟雾暴露+HNE组。

2.2大鼠气道上皮杯状细胞Sec3和MUC5AC蛋白的表达 与正常对照组比较，烟雾暴露组和烟雾暴露+HNE组大鼠气道上皮杯状细胞Sec3和MUC5AC蛋白相对表达水平明显升高，且烟雾暴露+HNE组变化更明显(P<0.05)。见图2、3。

2.3HNE对气道上皮杯状细胞Sec3、p-Sec3和MUC5AC蛋白表达的影响 与16HBE组比较，16HBE+HNE组气道上皮杯状细胞的Sec3、p-Sec3和MUC5AC蛋白相对表达水平明显升高(P<0.05)，且呈时间依赖性。见表2。

注：A为正常对照组；B为烟雾暴露组；C为烟雾暴露+HNE组。

注：A为正常对照组；B为烟雾暴露组；C为烟雾暴露+HNE组。

表2 HNE对气道上皮杯状细胞Sec3、p-Sec3和MUC5AC蛋白表达的影响

2.4转染后Sec3蛋白和mRNA相对表达水平比较 与16HBE+HNE组和空质粒转染组比较，sh-Sec3组细胞Sec3蛋白和mRNA相对表达水平明显降低(P<0.05)。见表3。

表3 转染后Sec3蛋白和mRNA相对表达水平比较

2.5Sec3对HNE诱导的16HBE中MUC5AC分泌情况的影响 与16HBE+HNE组和空质粒转染组比较，sh-Sec3组细胞MUC5AC蛋白相对表达水平明显降低(P<0.05)，MUC5AC mRNA相对表达水平也降低，但差异无统计学意义(P>0.05)。见表4。

表4 Sec3对HNE诱导的16HBE中MUC5AC 分泌情况的影响

2.6免疫共沉淀鉴定Sec3与MUC5AC的相互作用 利用Sec3抗体和MUC5AC抗体进行蛋白免疫印迹实验，结果显示Sec3蛋白可被MUC5AC抗体共沉淀，MUC5AC蛋白亦可被Sec3抗体共沉淀，且在HNE刺激下，这种相互作用可明显加强。见图4。

注：a为阳性对照组(沉淀前总蛋白)；b为16HBE组；c为16HBE+HNE组；d为阴性对照组(小鼠IgG沉淀)；A为以Sec3抗体进行沉淀，MUC5AC蛋白进行蛋白免疫印迹实验；B为以MUC5AC抗体进行沉淀，Sec3蛋白进行蛋白免疫印迹实验。

3 讨 论

慢性呼吸系统疾病为临床常见疾病，且为我国居民死亡的主要原因之一。在大气污染和吸烟等因素影响下，慢性呼吸系统疾病的发病率呈逐年上升趋势[8]。气道黏液高分泌为呼吸道常见病理改变，尤其在慢性气道炎症疾病急性发作时，气道黏液分泌可表现为异常高分泌[9]。气道黏液高分泌可致气流受限、肺泡表面活性物质降低、氧自由基产生，参与慢性气道炎症疾病进展，影响预后[10]。有研究表明，哮喘、慢性阻塞性肺疾病等慢性呼吸系统疾病中均有黏蛋白的过度表达，其中MUC5AC与气道黏液高分泌的形成密切相关[11]。另有研究发现，在慢性气道炎症急性发作时，支气管上皮细胞MUC5AC的表达上调可能与其胞外分泌有关[12]。对于大多数真核细胞而言，胞外分泌为极性分泌过程，受Exocyst复合物调控。近年研究发现，Exocyst复合物可在极化上皮细胞中高度表达，在细胞极性建立和协调极化囊泡向特定膜区域运输中发挥重要作用[13]。但其参与气道黏液高分泌过程的具体机制尚未完全明了。

本研究利用香烟烟雾暴露法构建慢性支气管炎症的病理性改变，结果大鼠气道上皮杯状细胞增生，黏液分泌量增加，MUC5AC蛋白表达增加，提示模型构建成功，符合以往报道结果[14]，表明MUC5AC高表达参与了慢性支气管炎症病理过程。HNE为中性粒细胞分泌的酶类蛋白质。已有研究证实，HNE与哮喘、慢性阻塞性肺疾病等多种呼吸系统疾病急性发作密切相关，且为重要的促黏液分泌因子[15]。本研究利用HNE处理慢性支气管炎症大鼠模型，结果发现与单纯烟雾暴露比较，HNE处理后可刺激气道上皮杯状细胞增生，黏液分泌，进一步上调MUC5AC蛋白水平，提示模型构建成功，符合以往报道结果[16]，表明HNE可刺激气道上皮杯状细胞的MUC5AC高分泌。Sec3为Exocyst复合物构成亚基之一，可不完全依赖囊泡转运途径到达细胞质膜分泌位点。研究发现，Sec3可能是Exocyst复合物介导的极性胞外分泌过程关键亚基[17]。本研究结果显示，慢性炎症大鼠模型中，气道上皮细胞中Sec3表达增加；此外，在HNE处理的16HBE中，Sec3表达也增加，表明Sec3参与气道黏液高分泌过程。HNE处理16HBE后，Sec3的磷酸化水平升高，表明在HNE诱导的高分泌细胞模型中，不仅Sec3的总蛋白表达增加，其蛋白活性也增加。同时，经HNE处理的16HBE中的MUC5AC的蛋白表达水平升高，这表明Sec3与MUC5AC在气道高分泌模型中的表达趋势是一致的。

由于Exocyst复合物是介导细胞内蛋白极性的关键因子，Sec3又是细胞分泌位点空间标志物，并且在极化上皮细胞中高度表达，因此胞外分泌过程均受Exocyst复合物的调控，而且Sec3可能在上皮细胞胞外分泌过程中发挥重要作用。本研究结果显示，采用sh-Sec3转染16HBE，其Sec3蛋白表达水平降低，同时MUC5AC的蛋白表达也被抑制，这表明MUC5AC蛋白的表达可能受到Sec3蛋白的调控；而MUC5AC又与气道黏液高分泌形成密切相关，因此可推论出Sec3可能参与了气道黏液高分泌的病理形成过程。本研究免疫共沉淀实验结果表明，Sec3与MUC5AC蛋白间存在着较为密切的相互作用，这也为Exocyst复合物亚基Sec3通过影响MUC5AC蛋白表达，进而调控气道黏液高分泌的病理过程提供了新的实验证据。

综上所述，Sec3参与气道黏液高分泌过程，且与MUC5AC在体内外环境中均具有相互作用，介导了HNE诱导的MUC5AC高分泌。Sec3有可能作为抑制MUC5AC合成，减轻气道黏液高分泌的治疗靶点。