双季板栗果实坏死病病原菌的生物学特性及鉴定

孙万霞潘晓芳韦继光杨来安

(1．广西大学林学院，广西 南宁 530004；2．广西大学农学院，广西 南宁 530004)

板栗Castanea mollissima属于壳斗科Fagaceae栗属Castanea多年生落叶乔木，被称为世界四大干果之一[1]，具有较高的营养价值和经济价值。目前我国板栗的栽培面积排在世界首位，品种约有300多个，且栽培历史悠久。目前，广西隆安县板栗总面积达1．07万hm2，年产板栗2 250 t，面积和产量均位于广西首位，具有“板栗之乡”的美称，主要在乔建、古潭、城厢、那桐和南圩等全县10个乡镇种植，分别有“九家种”“处署红”“隆安26号”“油栗”和“大毛栗”等5个主栽品种[2]，近几年新引进“日本8号”早熟品种等。随着双季板栗种植面积扩大，双季板栗果实病害发生也日益严重，甚至导致双季板栗采前果实腐烂脱落，严重影响双季板栗产量，因此，对双季板栗果实病害进行深入调查及防治方法研究迫在眉睫[3]。侯保林 等研究板栗种仁斑点类病害发现，主要病原菌是盘长孢状刺盘孢Colletotrichum gloeosporioidesPenz、链格孢Alteruaria alternata、腐皮镰孢菌Fusarium solani、串珠镰孢菌Fusarium moniliforme、三线镰孢菌Fusarium tricinctum和扩展青霉Penicillium expansum[4]；殷莉研究发现，板栗贮藏期间病害的病原有很多种，均属于半知菌类，丛梗孢目[5]。

目前双季板栗已报道的研究多为种植或栽培等方面，病害方面也只是对其叶、枝方面发生病害的研究，对其果实病害方面研究报道较少，缺乏针对其病害调查及防治等方面的研究。为明确广西隆安县双季板栗果实病害的发生情况，在隆安县定军村种植区开展双季板栗病害种类调查，对其病原菌进行形态学和分子生物学鉴定，及致病性验证，并对双季板栗果实病害进行药剂防治室内筛选及毒力测定，以期为双季板栗果实病害防治提供科学依据。

1 材料与方法

1．1 双季板栗林地概况

广西隆安县，属南亚热带季风气候，年平均气温21．7℃，最热月和最冷月平均气温分别为28．2℃和12．9℃；年平均降水量1 310．1 mm，年均蒸发量1 652．5 mm，空气相对湿度80%，其中4—10月降水量占全年的87．5%。该县日照充足，四季差异较小，按平均温度统计，该地区属于春秋相连，夏长无冬或基本无冬，四季皆适宜耕作。调查地在隆安县定军村双季板栗种植区。

1．2 试验仪器

恒温光照培养箱DHP－9162，太仓市科教器材厂；干燥自动排气立式高压蒸汽灭菌锅LDZF－75KB，上海申安器械厂；生物光学显微镜OLYMPUS CX21，日本东京奥林巴斯公司；DNA电泳槽DYCP－31DN、稳压电泳仪DYY－5，北京六一仪器厂；电热恒温水槽DK－8D，上海一恒科学仪器有限公司；凝胶成像仪FR980，上海复日科技仪器有限公司；PCR 仪2720 thermal cycler、测序仪3730XL，Applied Biosystems；冷冻高速离心机HC－2518R，BBI生物科学；Surf系列精密单道可调移液器SP10－1000，生工生物(上海)有限公司。

1．3 病害田间调查方法

2016年5月—2018年9月，采用线路踏查法对双季板栗种植区进行果实病害种类调查。在同一林分行间逐一观察植株，记录病害发生的种类、症状、严重程度，分析症状类型、发生规律，观察记录病果数量，计算发病率和病情指数。病果采集应在晴天中午进行，采集带有典型症状的病果样本，分别按类型装袋、挂好标签，将样本带回实验室，待分离纯化和鉴定。双季板栗病情分级标准参照方中达所著的«植病研究方法(第三版)»[6]，病害分级如表1所示，果实、叶部及枝条类病害都按此分级标准分类。

表1 病害严重度分级标准Tab.1 Grading standards of different disease severity

1．4 病原菌分离纯化及鉴定

1．4．1 分离纯化

对病果各危害部位组织分离[7]。将漂洗过的病果置于提前放有无菌滤纸的培养皿中，吸去表面水分后，用高压灭菌手术刀切取果实病部块状组织长宽各约5 mm，接种于灭菌后的马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基上，每个培养皿内放置组织块4～5个，每个果实病部重复做5～6个培养皿，编号后放入28℃恒温培养箱中培养，每日观察记录。

待菌丝长出后，用灭菌接种针从菌落边缘挑取新鲜菌丝接种到PDA培养基上继续培养，如此反复培养，直至得到单一菌株。对所得菌株编号，将纯化后菌株接种至PDA培养基试管中，置于4℃冰箱备用。

1．4．2 致病性测定

接种前，挑取菌落边缘菌丝接种于PDA培养基上培养活化。5 d后将已活化的病原菌，在平展边缘处取长宽各为5 mm大小一致的菌丝块，分别进行活体接种和离体接种。设置针刺伤法和无伤接种法2种处理，每处理接种果苞数量30个，并以同等大小空白PDA培养基处理作为空白对照。每处理设3次重复。对于双季板栗果实的离体接种，根据其组织面积大小接种不同数量菌丝块，使用吸满无菌水的滤纸放入一定大小的无菌培养皿中，并定期喷洒无菌水保湿；野外活体接种，使用无菌保鲜袋进行保湿，保湿时间为3～5 d，并用芭蕉叶覆盖防止晒伤。此后每天观察并记录发病情况，待出现病状后，对发病部位再分离，若仍能得到相同菌株，即确定为病原菌。

1．4．3 病原菌鉴定

1．4．3．1 病原菌形态学鉴定 将纯化好的病原菌菌种在适宜温度条件下进行活化培养并逐日观察记录病原菌的培养性状，如菌落大小、颜色、形状和致病程度等。采用插片法在光学显微镜下观测病原菌的菌丝、产孢梗和孢子的大小及形态特征[8]。光学显微镜下，观察病原菌孢子形态特征[9]。

1．4．3．2 病原菌分子生物学鉴定 提取活化后的病原菌菌丝，通过ITS－PCR方法对双季板栗果实坏死病病菌进行鉴定。PCR反应总体积25 μL，内含 10 × Buffer 2．5 μL， Template 0．5 μL， dNTP 1 μL，Taq 酶 0．2 μL，引物 (10 μmol/L)各0．5 μL，加双蒸水至25 μL。PCR反应条件为94℃预变性4 min，94 ℃变性 45 s，55 ℃退火 45 s，72 ℃延伸1 min，30个循环，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存，终止反应。PCR产物的纯化和序列测定委托生工生物工程(上海)股份有限公司完成。对测定结果，在美国国立生物信息中心NCBI网页上进行Blast比对分析，利用MAGA7．0构建系统发育进化树进行分析并与真菌的形态学观察及生理生化特征相互验证。

1．5 病原菌生物学特性研究

取出4℃斜面保存的菌株接种于PDA培养基上，置于28℃培养箱活化培养6 d后备用。

1．5．1 不同温度对病原菌菌丝生长的影响

将活化后的菌株于菌落边缘处取新鲜菌丝转接至PDA培养基中，按菌株类型编号，并放置于10，16，22，25，28，34，40 ℃等 7 个不同温度环境培养箱培养，每个温度处理重复3次。培养6 d后，测量菌落直径。

1．5．2 pH对病原菌菌丝生长影响

PDA培养基降至50℃以下时，在无菌操作台加入配制好的1 mol/L HCL与1 mol/L NaOH溶液，混合均匀，将培养基 pH 值调至 2，3，4，5，6，7，8，9，10。在菌落边缘平展处取长宽各5 mm菌丝块，接种至不同pH值培养基，于28℃恒温培养，设置3次重复。培养6 d后，测量菌落直径。

1．5．3 不同光照对病原菌菌丝生长影响

在边缘平展处取长宽各5 mm菌丝块，接种至PDA培养基中央。接种后分别放置于全黑暗(6 d)、全光照(6 d)、光暗交替培养(先光照3 d，再黑暗3 d)的28℃恒温培养箱培养。每处理3次重复。培养6 d后，测量菌落直径。

2 结果与分析

2．1 双季板栗果实病害症状

通过对果顶变黑、果顶开裂并感染和其他部位变黑3种果实病害类型(图1)的病果部位进行分离培养、纯化及致病性试验，根据菌落颜色、形状、疏密程度、生长速度和生长状况等，获得3种菌株，分别编号 ZH －1，Hei－2，Fen－3。

图1 果实病害症状Fig.1 Symptom of fruit necrosis

2．2 病原菌致病性试验

接种病原菌3～4 d后，刺伤果实接种的双季板栗果实表现出发病症状，果苞表面产生一层白色菌丝，不断向外扩张。接种7 d后，刺伤接种果实周围产生大量菌丝，近伤口处呈灰黑色，果实外部果苞果刺变黄、开裂，直至果实脱落。各个处理平均发病率为29．97%，其中 ZH －1，Hei－2，Fen－3 菌株发病率分别为 34．08%，29．17%，37．87%，为优势菌株，多以2种或3种同时侵染双季板栗。

2．3 果实病原菌形态学特征

菌株ZH－1菌落生长速度慢，培养10 d可长满培养皿，气生菌丝体为白色至淡紫色。菌落突起絮状，稀疏或浓密，高3～5 mm，背面呈白色、米黄色或红紫色。液体培养基培养3 d后，小型分生孢子为长椭圆形或纺锤形，无色透明，少数为1隔，多数为2个隔膜，大小约为7．2 μm ×3．6 μm；大型分生孢子为镰刀形或纺锤形，有足孢，1～4个隔膜，多为3个隔膜，大小约为38．20 μm ×4．66 μm(图2)。

图2 菌株ZH-1菌落形态及孢子形态Fig.2 Colony and spore morphology of ZH-1 strain

菌株Hei－2菌落生长速度很快，培养2 d后即长出菌丝，4 d后长满整个培养皿，日生长量约4 cm。菌落整齐而平坦，气生菌丝体绒状或棉絮状。菌落初期为灰白色，生长中期中间出现灰黑色，后期渐变为灰褐色至黑色，背面呈黑色。液体培养基培养5 d后，未成熟的小型分生孢子为单孢，呈卵圆形或椭圆形，无色透明，大小约为18．29 μm ×8．82 μm(图3)。

图3 菌株Hei-2菌落形态及孢子形态Fig.3 Colony and spore morphology of Hei-2 strain

菌株Fen－3菌落生长速度较慢，培养7 d后可长满培养皿。菌落生长初期为淡粉色，后期为白色棉絮状，稀疏或浓密，背面为粉紫色。液体培养基培养3 d后，小型分生孢子呈卵圆形，有时无隔或1隔膜，大小约 2．4 μm ×1．2 μm；大型分生孢子为卵圆形或椭圆形，无色透明，约1～3个隔膜，多为2隔，大小约 19．95 μm × 5．71 μm(图4)。

图4 菌株Fen-3菌落形态及孢子形态Fig.4 Colony and spore morphology of Fen-3 strain

2．4 病原菌分子生物学鉴定

菌株ZH－1与供试菌株MF629741．1Fusarium oxysporumstrain在同一分支上，同源性达到100%；菌株Fen－3与供试菌株KJ767073．1Fusarium pro-liferatumisolate在同一分支上，同源性达到100%，并且2种菌株的遗传距离最近，同源性达到100%，因此可以确定菌株ZH－1和菌株Fen－3是隶属于Fusarium属。其中，菌株ZH－1为尖孢镰刀菌Fu-sarium oxysporum，菌株Fen－3为层出镰刀菌Fusarium proliferatum(图5)。

图5 三种病原菌的ITS序列系统发育树Fig.5 Phylogenetic trees of ITS sequences of three pathogens

菌株 Hei－2 与 MG386642．1Lasiodiplodia theobromae、MH062942．1Lasiodiplodia pseudotheobromaestrain、MF952733．2Lasiodiplodia brasiliensisisolate和 MH454031．1Lasiodiplodia theobromaestrain 在同一个分支上，其同源性达到100%，因此可以确定菌株Hei－2是隶属于Botryodiplodia属，为可可球毛色二孢Lasiodiplodia theobromae(图5)。

2．5 病原菌生物学特性

2．5．1 不同温度对菌丝生长的影响

3种菌种菌丝生长在不同温度下具有明显差异性。在10～34℃均可以生长，在16～34℃生长良好。培养6 d后，菌丝最适生长的温度为25～28℃(表2)。

在34℃下，菌丝生长缓慢；低于10℃或高于34℃，菌丝生长明显受到抑制。不同温度下，同一菌株差异较大(表2)，菌丝颜色未完全变黑成型，表现为中间变黑，周围新长菌丝为白色，但25℃条件下菌落全部变黑。当达到40℃时，3种菌株菌丝均不能萌发生长(表2)。

表2 不同温度处理对菌丝生长的影响Tab.2 Effects of different temperature treatments on mycelium growth

2．5．2 不同光照对菌丝生长影响

供试菌株在全黑暗(6 d)、全光照(6 d)和光暗交替(光照3 d，黑暗3 d)等3种光照条件下，3种菌株菌丝均能生长(表3)。其中，最利于3种菌株菌丝生长的光照条件为全黑暗(6 d)，菌落直径最大。光暗交替(光照3 d、黑暗3 d)处理最不利于3种菌株菌丝生长。

表3 不同光照处理对菌丝生长的差异性分析Tab.3 Difference analysis of mycelium growth under different light treatment

2．5．3 不同pH值对菌丝生长的影响

3种菌株的菌丝生长速度在不同pH条件下有差异。菌丝生长的酸碱范围pH 2～10。其中，菌株Fen－3耐酸性最大，在pH值为2条件下仍能生长，菌丝长度为0．13 cm。3种菌株均为耐碱菌株，在pH值为10条件下仍能生长。其中，Hei－2耐碱性最大，在pH值为10条件下，菌丝长度为8．93 cm。3种菌株菌丝生长的最适pH值均为7，菌落直径分别为 4．57，9．00，7．03 cm，随着 pH 值的增大或减小，菌落直径减小。(表4)

3 结论与讨论

通过致病性试验、病害症状识别、形态学鉴定以及基于rDNA－ITS片段DNA序列的分子生物学鉴定，认为危害广西隆安县双季板栗采前果实坏死病害的病原菌共有尖孢镰刀菌，可可球毛色二孢，层出镰刀菌，其中尖孢镰刀菌为最新发现。25～28℃，全黑暗条件，pH值为7是3种菌株最适生长条件。陶怡采集未成熟期和成熟期果实上分离得到层出镰刀菌Fusarium proliferatum、可可球毛色二孢Lasiodiplodia theobromae，认为研究对象可能是贮藏前果实已经感染[10]，梅汝鸿 等对采后板栗果实病害研究中发现病原菌有10多种，其中干枯病是一种影响采后板栗果实的重要真菌性病害，其病原菌为镰刀菌Fusariumsp．[11]；但以上研究均未得出具体菌种，但是可以肯定的是危害板栗果实的镰刀菌属从南到北均有危害。

赵学平等通过对板栗贮藏期病害鉴定，得出危害板栗果实贮藏期间的病原不是一种，也是2～3种病原菌共同危害[12]，Turchetti[13]和梅汝鸿 等[11]在研究板栗贮藏期间的病害时也得出相同的结论。以上研究与本研究结果一致，可以认为双季板栗果实病害不论在采前或者采后，贮藏期间均为多种病原共同危害的结果。赵相超[14]的研究结果显示，菌丝生长的pH值范围为5～12、温度为15～35℃，与本研究所设范围有所差异，虽然研究地点和品种不同，但其适宜范围相同，也证明了层出镰刀菌、可可球毛色二孢在生物学特性方面不因地域上的差异而有较大差别。