扶正合剂质量标准提高研究

卢向红 贺敏才 汪 霞

湖南省娄底市食品药品检验检测所,湖南 娄底 417000

扶正合剂是由湘潭建春医院制剂室生产的中药制剂，其处方组成为黄芪、鸡血藤、补骨脂和女贞子。具有益气养阴的功效，临床主要用于恶性肿瘤及其放疗、化疗后气阴两虚所致面色不华、神疲乏力、口干咽燥的辅助治疗[1]。该药处方中黄芪为君药，现代药理实验[2]表明黄芪中黄芪甲苷具有增强机体免疫力、提高机体抗病毒能力、抗应激功效、作为促生长剂及改善心肺功能等作用。补骨脂为臣药，现代药理研究[3]表明其具有抗肿瘤、抗氧化、抗真菌等作用，《中国药典2020年版》以补骨脂素和异补骨脂素，作为药材和饮片质量控制的指标性成分[4]。扶正合剂现行的质量标准为《湖南省医疗机构制剂规范2016年版》，标准中仅有性状鉴别、薄层色谱鉴别、相对密度、pH值及制剂通则项下的检查项目，缺少有效成分含量测定的项目，制剂质量难以得到有效地控制。本文采用高效液相色谱法[5]测定扶正合剂中黄芪甲苷、补骨脂素和异补骨脂素的含量，制定了与临床疗效相关的成分含量控制方法，对增强药品质量可控性，保证临床用药安全有效，具有十分重要的意义，为进一步提高和完善药品质量标准提供科学依据。

1 仪器与试药

Waters HPLC色谱仪(e2695-W2424)，Empower 色谱工作站。Thermo Fisher HPLC色谱仪(U3000)， Chromeleon色谱工作站。梅特勒托利多 XSE205DU电子天平(十万分之一)。水为I级纯化水，乙腈(HoneyWell，批号：T8FA1H)为色谱纯，磷酸(国药集团化学试剂有限公司，批号：20190301)为优级纯，正丁醇(国药集团化学试剂有限公司，批号：20200703)，氨水(国药集团化学试剂有限公司，批号：20191105)，甲醇(国药集团化学试剂有限公司，批号：20180518)均为分析纯。

黄芪甲苷对照品购自中国食品药品检定研究院(批号：110781-201717，含量96.9%)；补骨脂素购自中国食品药品检定研究院(批号：110739-201617，含量99.7%)；异补骨脂素购自中国食品药品检定研究院(批号：110738-201715，含量99.5%)；扶正合剂：湘潭建春医院制剂室，批号201125、200710、201110。

2 试验方法与结果

2.1 色谱条件

2.1.1 黄芪甲苷色谱条件 色谱柱：Waters SunFire C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，柱温：30 ℃，流动相：乙腈-水(34∶66)，流速：1.0 mL·min-1，蒸发光散射检测器(漂移管温度：80.0 ℃，气体压力为30 psi，增益值为150，喷雾器温度：42.0 ℃)。

2.1.2 补骨脂素和异补骨脂素色谱条件 色谱柱：Shim-Pack VP-ODS 柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，柱温：30 ℃，乙腈-0.1%磷酸溶液(30∶70)，流速∶1.0 mL·min-1，二极管阵列检测器，检测波长：245 nm。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 对照品溶液1：精密称取黄芪甲苷对照品17.68 mg，加甲醇制成每 1 mL 含黄芪甲苷0.3426 mg·mL-1的溶液，备用。

对照品溶液2：精密称取补骨脂素对照品10.95 mg，加甲醇制成每1 mL含补骨脂素 0.4367 mg·mL-1的溶液，精密称取异补骨脂素对照品10.60 mg，加甲醇制成每1 mL含异补骨脂素0.5274 mg·mL-1的溶液，各精密取1.00 mL，加甲醇配成含补骨脂素8.734 μg·mL-1和异补骨脂素10.547 μg·mL-1混合对照品溶液，备用。

2.2.2 供试品溶液的制备 供试品溶液1：取本品10支内容物混匀，精密量取20 mL，用水饱和正丁醇液提取3次(50 mL，30 mL，30 mL)，合并正丁醇液，加氨试液30 mL，摇匀，放置16 h，弃去水层，再用正丁醇饱和的水100 mL洗涤，取正丁醇液蒸干，残渣用甲醇溶解并转移至5 mL量瓶中，摇匀。

供试品溶液2：取本品10支内容物混匀，精密量取10 mL，置25 mL容量瓶中，加甲醇10 mL，超声提取30 min，放冷，用甲醇稀释至刻度，摇匀。

2.2.3 阴性对照溶液的制备 取分别缺黄芪、补骨脂的处方制成阴性样品，再分别按供试品溶液制备方法制备阴性对照溶液1和阴性对照溶液2。

2.3 系统适用性试验

2.3.1 黄芪甲苷 分别取对照品溶液1、供试品溶液1、阴性对照溶液1进样20 μL，色谱图见图1。黄芪甲苷峰保留时间约为15 min，阴性对照色谱图在黄芪甲苷峰位置无干扰峰。

2.3.2 补骨脂素与异补骨脂素 分别取对照品溶液2、供试品溶液2、阴性对照溶液2进样10 μL，色谱图如图2，阴性对照色谱图在补骨脂素与异补骨脂素峰位置无干扰峰。

2.4 线性关系考察

2.4.1 黄芪甲苷 精密吸取对照品溶液10、15、20、25、30 μL按上述色谱条件测定，以峰面积对数为纵坐标，以进样量对数为横坐标，进行线性回归，得方程见表1。

2.4.2 补骨脂素与异补骨脂素 精密吸取对照品溶液5、10、15、20、25 μL按上述色谱条件测定，以峰面积为纵坐标，以进样量为横坐标，进行线性回归，得方程见表1。

1.黄芪甲苷图1 对照品(A)、扶正合剂样品(B)、缺黄芪阴性样品(C)的HPLC色谱图

1.补骨脂素;2.异补骨脂素图2 对照品(A)、扶正合剂样品(B)、缺补骨脂阴性样品(C)的HPLC色谱图

表1 扶正合剂中黄芪甲苷、补骨脂素和异补骨脂素的线性关系考察结果

2.5 精密度试验 取对照品溶液连续进样6次，记录峰面积，结果黄芪甲苷、补骨脂素和异补骨脂素峰面积的RSD分别为2.67%、0.12%和0.11%，表明仪器精密度良好。

2.6 重复性试验 取同一批号(201125)样品6份，按2.2.2项下供试品液制备方法，分别制备成供试品溶液，依法测定，结果黄芪甲苷、补骨脂素和异补骨脂素含量RSD分别为0.96%、1.55%和1.54%，表明本法重复性好。

2.7 稳定性试验 取同一样品溶液(批号：201125)在0、2、5、10、15、24 h分别进相同体积，依法测定，黄芪甲苷、补骨脂素和异补骨脂素峰面积RSD分别为2.59%、0.13%和0.11%，表明样品溶液在24 h内稳定。

2.8 加样回收试验 精密取已知含量(黄芪甲苷0.09989 mg·mL-1)的同一样品(批号：201125)10 mL，精密加入黄芪甲苷对照品溶液(0.4364 mg·mL-1)1 mL、2 mL、3 mL各3份。精密取已知含量(补骨脂素32.194 μg·mL-1，异补骨脂素 41.778 μg·mL-1)的同一样品(批号：201125)5 mL，精密加入含补骨脂素(0.3220 mg·mL-1)和异补骨脂素(0.4219 mg·mL-1)混合对照品溶液0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL各3份，按2.2.2项下供试品液制备方法分别制备，按样品测定方法测定含量，计算回收率，结果见表2，表明该方法准确度良好。

表2 扶正合剂中黄芪甲苷、补骨脂素和异补骨脂素加样回收试验结果 (n=9)

2.9 样品测定 取三批样品，按2.2.2项下方法分别制备供试品溶液，依法测定黄芪甲苷、补骨脂素和异补骨脂素的含量，结果见表3。

表3 扶正合剂中黄芪甲苷、补骨脂素和异补骨脂素含量测定结果

3 讨论

3.1 提取方法的选择

3.1.1 黄芪甲苷提取 通过查找文献[5],黄芪中黄芪甲苷由两部分组成，一部分是游离的黄芪甲苷，一部分是来自于黄芪甲苷衍生物的转化，这两部分黄芪甲苷的总和才是黄芪饮片中黄芪甲苷的总含量。黄芪甲苷衍生物转化成游离的黄芪甲苷一般采用碱化的方法，其原理是黄芪甲苷衍生物在碱的作用下发生水解，转变成游离的黄芪甲苷就可以被检测到。影响黄芪甲苷衍生物的转化的关键因素是氨试液的碱化时间，本实验考察了加入氨试液振摇以后放置不同时间对黄芪甲苷含量的影响，放置20 min、1 h、16 h黄芪甲苷含量明显逐渐升高，放置24 h与16 h的黄芪甲苷的含量变化不大，因此本实验采用放置16 h。

提取溶剂的碱性加大到一定程度后，可能会造成黄芪甲苷的结构破坏使其含量降低，因此本实验考察了加入不同体积氨试液对黄芪甲苷含量的影响，分别加入氨试液15 mL、30 mL、50 mL以及100 mL，结果加入15 mL和100 mL氨试液测得的黄芪甲苷含量比加入30 mL、50 mL氨试液测得的量低，从降低检验成本及环保角度考虑，本实验采用加入30 mL氨试液的方法。

本实验考察了水饱和正丁醇提取次数对含量测定结果的影响，分别用水饱和正丁醇提取5次(30 mL、20 mL、20 mL、20 mL、20 mL)，提取3次(50 mL、30 mL、30 mL)，结果黄芪甲苷含量变化不大，从提高检验效率考虑，本实验采用提取3次的方法简化实验步骤。

3.1.2 补骨脂素和异补骨脂素提取 本实验对补骨脂素和异补骨脂素的提取方法进行了探索，补骨脂素和异补骨脂素属于呋喃香豆素类[6]，本实验曾用乙酸乙酯萃取，萃取液蒸干再用甲醇溶解稀释；用甲醇超声提取等前处理方法，结果用乙酸乙酯萃取后，保留时间5 min之前的杂质峰有所减少，但是操作复杂，用甲醇超声提取，测出样品含量比较高，样品中其他成分峰对主峰无干扰，结果准确，重复性好，因此本实验采用甲醇超声提取的方法。考察了提取15 min、30 min和45 min 3个时间，结果提取15 min含量偏低，30 min和45 min含量没有显著差异，因此本实验采用30 min超声提取。

3.2 检测方法选择 黄芪甲苷的紫外吸收为末端吸收，在紫外检测器下的响应值低，因此本实验采用通用型的蒸发光散射检测器，仪器灵敏度高，信号稳定。采用二极管阵列检测器在190～400 nm波长范围内进行全波长扫描，结果补骨脂素和异补骨脂素在245 nm波长处有最大吸收，为提高检测灵敏度，因此选择245 nm作为补骨脂素和异补骨脂素的检测波长。

3.3 流动相选择 蒸发光散射检测器的流动相不能使用非挥发性的试剂[7]，通过查阅文献[8-10],黄芪甲苷的测定大部分采用乙腈-水流动相系统，经过反复比较不同比例，采用乙腈-水(34∶66)等度洗脱，样品中黄芪甲苷与相邻峰达到基线分离，峰形对称性好。通过查阅文献[11-12],在实验过程中分别考察了甲醇-水，乙腈-水，0.1%磷酸溶液-乙腈，0.4%磷酸溶液-乙腈等流动相系统及多个比例，经过反复比较，采用0.1%磷酸溶液-乙腈(70∶30)等度洗脱，补骨脂素、异补骨脂素与相邻峰达到基线分离，峰形对称性好，出峰时间合适。

4 结论

黄芪和补骨脂分别为扶正合剂中的君药与臣药，黄芪甲苷为黄芪的功效性成分，补骨脂素和异补骨脂素为补骨脂的指标性成分，本实验采用高效液相色谱法测定扶正合剂中黄芪甲苷、补骨脂素和异补骨脂素的含量，结果准确，重复性好，专属性强，且样品前处理方法简便，提取效率高，为更好地控制扶正合剂的质量提供了依据。