MVBs及IL-1β在2型糖尿病大鼠血管钙化中的作用

郑 杨，魏海军，申嘉陵， 刘润禹，刘 勇，孙晓磊

(西南医科大学附属医院 血管外科， 四川 泸州 646000)

心血管疾病是2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)患者死亡的主要原因[1-2]，其中血管钙化(vascular calcification，VC)是一个重要的危险因素[3]，是糖尿病患者心血管死亡率的最佳预测指标[4-5]。临床证据表明VC通常影响T2DM人群的内侧动脉层，但其发生发展的分子生物学机制仍然存在较大的争议。因此，需进一步明确糖尿病血管钙化的分子病理机制。

近年来大量研究发现，当血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)受到氧化应激、炎性因子等刺激，会释放基质囊泡(matrix vesicles bodies，MVBs)至细胞外基质，形成易于钙磷沉积的微环境，从而启动血管钙化的发生[6]。另一方面，白细胞介素 1β(interleukin 1β，IL-1β)是T2DM患者靶向的主要炎性细胞因子，其分泌与自噬、MVBs形成和微囊泡脱落等有关[7]。体内IL-1β水平升高与血管钙化密切相关[8-9]，而MVBs释放增加可以使磷酸盐诱导的血管钙化加重。然而，在T2DM相关的血管钙化中， MVBs如何促进钙化以及IL-1β如何参与其中仍然未知。因此，本文就MVBs及炎性介质IL-1β在2型糖尿病血管钙化中的作用展开进一步研究。

1 材料与方法

1.1 主要材料

SPF级雄性SD大鼠，体质量200～250 g{西南医科大学实验动物中心[许可证号：SCXK(川)2013-17]}。所有动物实验均已获得西南医科大学实验伦理委员会批准(20160059)。β-磷酸甘油(β-Glycerophosphate，β-GP)、雷帕霉素、氯喹(Sigma Aldrich公司)、链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)(Solarbio公司)、兽用维生素D3(哈尔滨摩天农科兽药有限公司)；annexin-Ⅵ、IL-1β一抗(Abcam公司)；RUNX 2一抗(Cell Signaling Technology公司)；RNA反转录试剂盒、PCR试剂盒(Toyobo公司)；引物(成都擎科生物科技公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠的分组及处理：将大鼠随机分成正常组和糖尿病组(腹腔注射STZ)，以空腹血糖≥16.7 mmol/L确定为糖尿病模型造模成功，随后给糖尿病大鼠每天肌肉注射维生素D3(7.5 mg/kg)，连续注射30 d，制备糖尿病大鼠血管钙化模型。每组8只。

1.2.2 血管Von Kossa 染色检测血管钙化：石蜡切片常规处理后，按照全组织Von Kossa 染色试剂盒(solarbio)说明书进行染色，于显微镜下观察动脉钙化。

1.2.3 原代大鼠主动脉VSMCs的分离及钙化细胞模型的建立：1)原代大鼠主动脉VSMCs分离培养：肌肉注射1%戊巴比妥钠(5 mL/kg)麻醉大鼠，无菌条件下迅速取出胸主动脉，小心剥离血管周围结缔组织，贴块法培养VSMCs。2)细胞分组及钙化模型建立：对照组(control)：用含10%胎牛血清的DME-/F12培养基正常培养VSMCs；钙化组(calcification)：将VSMCs用含10%胎牛血清和10 mmol/L β-GP的高糖DMEM培养基进行培养，3 d更换1次新鲜培养基，诱导培养7 d，建立细胞高糖钙化模型。

1.2.4 茜素红染色检测钙化结节：将细胞接种于6孔板内，设置对照组和钙化组，培养7 d后用PBS洗涤，按照细胞茜素红染色试剂盒(Solarbio公司)说明书染色，于倒置显微镜下拍照观察。

1.2.5 免疫荧光染色检测RUNX 2、annexin-Ⅵ及IL-1β的表达：用4%多聚甲醛固定切片或细胞10 min，PBS洗涤后用0.2% Triton X-100和5% 驴血清室温共孵育2 h。之后加RUNX 2(1∶600)、annexin-Ⅵ(1∶600)、IL-1β(1∶100)一抗4 ℃孵育过夜。次日，用PBS洗涤后加入荧光二抗(1∶500)室温避光孵育2 h。PBS再次洗涤，吸干液体，用含DAPI的水性封片剂封片，荧光镜检。

1.2.6 Western blot检测RUNX 2、annexin-Ⅵ蛋白表达：提取VSMCs总蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白质，检测各组细胞中RUNX 2(1∶1 000)、Annexin-Ⅵ(1∶1 000)、GAPDH(1∶2 000)的表达。总蛋白相对表达量=总蛋白条带吸光度值/GAPDH条带吸光度值。

1.2.7 RT-qPCR检测RUNX 2、BMP-2、annexin-Ⅵ、IL-1β mRNA表达：用Nucleozol试剂盒提取VSMCs总RNA，反转录得到cDNA，配制20 μL的实时荧光定量PCR体系，进行实时荧光定量。反应条件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，循环40次。反应结束后，计算2-△△Ct值进行统计分析。引物见表1。

表1 反应引物Table 1 Primer

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 2型糖尿病大鼠血管钙化指标检测

腹腔注射STZ+肌肉注射维生素D3诱导糖尿病大鼠血管钙化模型(图1A)，STZ注射1周后，大鼠血糖显著升高(图1B，P<0.01)。18F-NaF-PET/CT影像学检查，钙化组CT显像发现明显斑块，且该部位18F-NaF高摄取浓聚(图1C，白色箭头)。大鼠主动脉的Von Kossa染色结果进一步证实钙化组大鼠有明显黑色钙盐银染颗粒沉积(图2)(P<0.05)。

A.establishment of vascular calcification model in diabetic rats; STZ, Streptozotocin; B.rat blood glucose level; *P<0.01 compared with the control group; C.18F-NaF-PET/CT imaging图1 糖尿病大鼠血管钙化模型建立Fig 1 Model of diabetic rats with vascular

A.representative image of Von Kossa staining of rat aorta (scale bar: 200 μm, 100 μm); B.the statistical graph of Fig A;*P<0.05 compared with the control group图2 大鼠主动脉Von Kossa染色Fig 2 Von Kossa staining of rat

2.2 各组大鼠主动脉中RUNX2、annexin-Ⅵ、IL-1β 的表达

与对照组相比，糖尿病血管钙化大鼠主动脉中促钙化基因RUNX 2、MVBs的标志物annexin-Ⅵ和炎性介质IL-1β的荧光强度明显增强(图3)。

A.RUNX 2; B.annexin-Ⅵ; C.IL-1β; scale bar=100 μm图3 大鼠主动脉免疫荧光染色Fig 3 Immunofluorescence staining of rat aorta

2.3 体外高糖钙化VSMCs钙化指标检测及annexin-Ⅵ、IL-1β的表达

与对照组相比，钙化组细胞有明显橘红色结节，茜素红染色呈阳性(图4A)，且成骨细胞样表型标志蛋白BMP-2(图4B)(P<0.01)及RUNX 2(图4C～E)(P<0.05，P<0.01)的表达显著升高。此外，annexin-Ⅵ和IL-1β的表达均上调(图5)(P<0.01，P<0.05)，且有明显共定位。

A.Alizarin red staining (scale bar=200 μm); B.RT-qPCR was used to detect the mRNA expression of BMP-2; **P<0.01 compared with the control group; C-E.qPCR (C), Western blot (D), immunofluorescence (E) were used to detect the expression of RUNX 2, scale bar=200 μm; *P<0.05, **P<0.01 compared with the control group图4 大鼠VSMCs钙化指标检测Fig 4 Detection of calcification in rat

A.Western blot was used to detect the expression of annexin-Ⅵ, **P<0.01 compared with the control group; B,C.RT-qPCR was used to detect the expression of annexin-Ⅵ and IL-1β, **P<0.01, *P<0.05 compared with the control group; D.immunofluorescence experiment to detect the expression of annexin-Ⅵ and IL-1β(scale bar=50 μm)图5 各组大鼠血管平滑肌细胞中annexin-Ⅵ、IL-1β的表达Fig 5 Expression of annexin-Ⅵ and IL-1β in rat

2.4 自噬对钙化细胞中RUNX 2、annexin-Ⅵ和IL-1β表达的影响

100 nmol/L雷帕霉素处理后，钙化细胞中促钙化基因RUNX 2、MVB标志物annexin-Ⅵ和炎性介质IL-1β的表达均降低(P<0.01)。25 μmol/L氯喹对钙化细胞中RUNX 2的表达无明显作用，但上调annexin-Ⅵ的表达(P<0.01)(图6)。

RT-qPCR was used to detect the mRNA expression of RUNX 2, annexin-Ⅵ and IL-1β in VSMC; *P<0.05, **P<0.01 compared with the control group; #P<0.01 compared with the β-GP group图6 自噬对钙化大鼠血管平滑肌细胞中RUNX 2(A)、annexin-Ⅵ(B)及IL-1β(C)表达的影响Fig 6 Effect of autophagy on the expression of RUNX 2 (A), annexin-Ⅵ (B) and IL-1β (C) in calcified rat

3 讨论

血管钙化是T2DM患者死亡的重要危险因素，是一个积极主动的、多因素参与的、可进行生物学调控的生理过程[10]，但关于其发生的确切机制仍需更深入的研究。

MVBs与血管钙化的发生密切相关。在病理状态下，血管平滑肌细胞会转变为合成表型以促进MVBs的分泌，并将靶细胞转变为钙化状态[11]。本研究从动物水平和细胞水平对T2DM血管钙化中的MVBs进行了研究，发现在T2DM钙化大鼠主动脉和高糖钙化细胞中促钙化基因BMP 2或RUNX-2增加的同时MVBs标志物annexin-Ⅵ的表达也明显升高。这些结果表明MVBs参与T2DM血管钙化的发生发展。

血管钙化的中心环节是VSMC向成骨细胞的表型转化，而动脉壁炎性细胞的激活及炎性因子的释放，可以通过促进VSMCs向成骨细胞表型转化参与血管钙化的调控[12]。慢性肾脏病大鼠在发生胸主动脉钙化过程中，VSMC向成骨样细胞转分化，促钙化基因BMP-2增加的同时，IL-1β、IL-6和TNF-α也增加[13]。本研究也发现，在T2DM钙化中IL-1β的表达明显升高，且与MVBs标志物Annexin-Ⅵ存在共定位，说明MVBs和IL-1β可能具有协同作用，共同参与生物体内钙化的形成。

自噬性细胞死亡是MVBs最重要的触发因素[14]。自噬抑制剂3-MA可以显著促进高磷诱导的MVBs释放，加重钙化程度[15]，因此，自噬可能是血管钙化的内源性保护机制，通过减少MVBs的释放，抵消高磷诱导的钙化[14]。本研究发现在T2DM血管钙化中，自噬可以调控MVBs的释放。诱导自噬，MVBs的释放减少，钙化程度减轻；而抑制自噬，MVBs的释放增加，钙化程度加重。进一步研究发现，诱导自噬还可以降低T2DM血管钙化中IL-1β的表达。这些结果表明，自噬可能通过调控钙化细胞MVBs的释放及炎性介质IL-1β的表达从而影响血管钙化的进程，但其具体机制仍需进一步研究。

总之，本研究通过体内与体外实验首次初步验证了 MVBs和IL-1β具有协同作用，共同参与T2DM血管钙化的形成；此外，自噬可能通过减少MVBs的释放，降低IL-1β等炎性因子的表达，从而减轻T2DM主动脉钙化。这些结果将为进一步探讨糖尿病动脉钙化发生发展中的分子机制提供新的线索，为阐明自噬抑制VC进程的中间机制提供新思路。