沙棘籽不同部位原花青素含量及抗氧化性研究

魏 璐，田建华，史 鹏

(山西省林业和草原科学研究院，山西 太原 030012)

沙棘(Hippophaerhamnoides)，胡颓子科灌木或乔木，别名醋柳，是极为珍贵的药食同源植物，主要分布于欧亚大陆的温带高山区[1]。原花青素是沙棘的主要生物活性成分之一，具有多种生理功能[2,3]。笔者采用盐酸-正丁醇法对沙棘籽不同部位的原花青素含量进行测定，并通过其对DPPH自由基、羟自由基和超氧阴离子的清除效果，分析评价其抗氧化性，以期为沙棘资源的开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

试验材料包括沙棘原料(购自山西省某沙棘饮料厂)、原花青素标准品(HPLC≥95%，成都曼斯特生物科技有限公司)、甲醇、正丁醇、盐酸、硫酸铁铵。

试验仪器包括JYL-C020E粉碎机(九阳股份有限公司)、Explorer pro分析天平(奥豪斯仪器有限公司)、HH数显恒温水浴锅(常州国宇仪器制造有限公司)、KQ-200VD型双频数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)、UV3100PC紫外-可见分光光度计(美普达仪器有限公司)、SC-3610低速离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司)。

1.2 试验方法

1.2.1 材料预处理

用簸箕从沙棘原料中分出沙棘籽、沙棘籽壳、提油沙棘籽渣(经超临界CO2萃取)，分别于-50 ℃用冷冻干燥机干燥24 h，粉碎，过80目筛，备用。

1.2.2 原花青素标准曲线的绘制

配置浓度为0 μg/mL、10 μg/mL、25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、150 μg/mL、200 μg/mL、250 μg/mL的原花青素标准系列工作液。吸取原花青素标准系列工作液各1 mL，置于安瓿瓶中，加入盐酸-正丁醇溶液6 mL、硫酸铁铵溶液0.2 mL，混匀，用封口钳将其密封，于沸水中加热40 min后取出，立即置于冰水中冷却至室温，于546 nm波长处测定吸光度，显色在1 h内稳定。以吸光度为纵坐标，原花青素浓度为横坐标绘制标准曲线。

1.2.3 原花青素含量测定

精密称取样品10 mg～100 mg，置于50 mL容量瓶中，加入30 mL甲醇，超声处理(功率250 W，频率50 kHz)20 min，放至室温后，加甲醇至刻度，摇匀，离心或静置澄清后取上清液作为供试品溶液。精密吸取供试品溶液1 mL，置于安瓿瓶中，按照标准曲线制作步骤执行，以只加盐酸-正丁醇溶液和硫酸铁铵溶液为空白对照。测定样品吸光度，用标准曲线计算试样中原花青素的含量，计算公式如下：

式中：X为试样中原花青素的含量，g/100 g；c为反应混合物中原花青素的量，μg/mL；V为待测样液总体积，mL；V1为样液反应体积，mL；V2为样液反应后总体积，mL；m为试样质量，mg。

1.2.4 原花青素抗氧化性测定

1)DPPH自由基清除能力测定。取不同浓度的原花青素提取液1.0 mL，加入0.004%的DPPH溶液3 mL，充分混匀，在黑暗条件下静置30 min，以无水乙醇作空白对照，相应浓度的VC和BHT作阳性对照，于517 nm波长处测定吸光度。每个样品3次重复，取平均值。计算公式如下:

DPPH自由基清除率(%)=(A2-A1)/A2×100%。

式中：A1为样品或阳性对照的吸光度，A2为空白对照的吸光度。

2)羟自由基清除能力测定。于比色管中分别加入7.5 mmol/mL硫酸亚铁溶液1 mL、7.5 mmol/L水杨酸-乙醇溶液1 mL，再加入不同浓度待测原花青素提取液1 mL，最后加0.8 mol/L过氧化氢溶液1 mL，35 ℃条件下水浴35 min，于510 nm波长处测定吸光度。空白对照以蒸馏水取代原花青素提取液,本底测试以蒸馏水取代过氧化氢，以VC和BHT作阳性对照。计算公式如下：

羟自由基清除率(%)=[A0-(Ax-Ax0)]/A0×100%。

式中：A0为空白对照的吸光度；Ax为样品或阳性对照的吸光度；Ax0为本底测试的吸光度。

3)超氧阴离子清除能力测定。在比色管中加入0.05 mol/L的Tris-HCl溶液(pH值为8.2)4.5 mL，于25 ℃下水浴保温20 min，加入不同浓度的原花青素提取液0.1 mL和3 mmol/L的邻苯三酚(用10 mmol/L的HCl配置)0.5 mL，混匀后于20 ℃条件下水浴6 min，再加入2滴8 mol/L的HCl终止反应，于320 nm波长处测定吸光度。空白对照以蒸馏水取代原花青素提取液，本底测试以蒸馏水取代邻苯三酚，以VC和BHT作阳性对照。计算公式如下：

超氧阴离子清除率(%)=[A0-(A1-A2)]/A0×100。

式中：A0为空白对照的吸光度，A1为样品或阳性对照的吸光度，A2为本底测试的吸光度。

2 结果与讨论

2.1 原花青素标准曲线

原花青素标准曲线见图1。

图1 原花青素标准曲线

由图1可知，原花青素标准曲线方程为y=0.004 6x-0.018 7，其相关系数R2=0.994 1。

2.2 沙棘籽不同部位原花青素含量

沙棘籽不同部位原花青素含量见第6页图2。

由图2可知，沙棘籽不同部位原花青素含量不同。原花青素含量最高的部位是沙棘籽壳，含量为66%；其次为沙棘籽，含量为45%；提油沙棘籽渣的原花青素含量最低，仅为8%左右。这是由于在超临界CO2萃取过程中，沙棘籽渣中的大部分原花青素随夹带剂被萃取，仅有少量留在残渣中。

图2 沙棘籽不同部位原花青素含量

2.3 沙棘籽不同部位原花青素的抗氧化能力

2.3.1 对DPPH自由基的清除能力

沙棘籽不同部位原花青素对DPPH自由基的清除能力见图3。

图3 沙棘籽不同部位原花青素对DPPH自由基的清除能力

由图3可知，沙棘籽不同部位原花青素提取液都有清除DPPH自由基的作用。3种原花青素提取液在10 μg/mL时已经具有清除DPPH自由基的能力，随着提取液浓度的增大，其对DPPH自由基的清除率也增大。当提取液浓度增大至某一值时，其对DPPH自由基的清除率达到最大值。当提取液浓度达到100 μg/mL时，3种样品原花青素对DPPH自由基的清除率和VC相近，约为95%左右。3种样品处于同一浓度时，其原花青素对DPPH自由基的清除能力为提油沙棘籽渣>沙棘籽壳>沙棘籽，这是由于不同样品中原花青素的聚合度不同。同常见的抗氧化剂相比，沙棘籽不同部位原花青素对DPPH的清除效果弱于VC，强于BHT。

2.3.2 对羟自由基的清除能力

沙棘籽不同部位原花青素对羟自由基的清除能力见图4。

图4 沙棘籽不同部位原花青素对羟自由基的清除能力

由图4可知，沙棘籽不同部位原花青素提取液都具有清除羟自由基的作用。其中，沙棘籽壳原花青素提取液对羟自由基的清除率呈缓慢增长趋势，当提取液浓度由20 μg/mL增长至600 μg/mL时，清除率由53%增加至90%，且沙棘籽壳原花青素提取液对羟自由基的清除率明显高于VC和BHT。沙棘籽和提油沙棘籽渣中原花青素对羟自由基的清除率仅在低浓度下呈现一定的增长，当浓度增加至100 μg/mL后趋于平缓，沙棘籽原花青素的羟自由基清除率维持在21%～31%，提油沙棘籽渣原花青素的羟自由基清除率维持在34%～45%，两者对羟自由基的清除效果均强于BHT，弱于VC。

2.3.3 对超氧阴离子的清除能力

沙棘籽不同部位原花青素对超氧阴离子的清除能力见图5。

图5 沙棘籽不同部位原花青素对超氧阴离子的清除能力

由图5可知，沙棘籽不同部位原花青素提取液都有清除超氧阴离子的作用，清除效果随浓度的增加而增加。样品和阳性对照在浓度为0.1 mg/mL时，对超氧阴离子的清除效果相近，清除率约为10%～20%；浓度为0.8 mg/mL时，对超氧阴离子的清除效果相差较大。沙棘籽壳原花青素的超氧阴离子清除率可达68.9%，高于其余样品和阳性对照，沙棘籽、提油沙棘籽渣原花青素的超氧阴离子清除率约为43%～53%，低于VC，高于BHT。

3 结论

本研究结果表明，沙棘籽不同部位的原花青素含量为沙棘籽壳>沙棘籽>提油沙棘籽渣。沙棘籽不同部位原花青素均具有清除DPPH自由基、羟自由基和超氧阴离子的能力，且清除能力在一定范围内和样品浓度呈正相关关系，清除效果优于常见的抗氧化剂BHT，但稍弱于VC，其中，沙棘籽壳中原花青素对羟自由基和超氧阴离子的清除效果优于VC。总体而言，沙棘籽中的原花青素具有较强的体外抗氧化能力，该资源的开发利用在生物医药领域有着巨大的应用潜力。