多指标权重分析法结合正交试验优选醋五灵脂炮制工艺△

李玲，彭致铖，严玉晶，邝敏，林嘉明，蔡盛康，张正

广东一方制药有限公司 广东省中药配方颗粒企业重点实验室，广东 佛山 528244

五灵脂为鼯鼠科动物复齿鼯鼠Trogopterus xanthipesMilne-Edwar 的干燥粪便[1]，始载于《开宝本草》，又名药本、寒号虫粪等。其主要成分有黄酮类、酚酸类、三萜类和核苷类等[2]，具有活血止痛、化瘀止血、消积解毒等作用，临床常用于心腹血气诸痛、经闭、产后血瘀疼痛、崩漏下血、虫蛇咬伤等[3]。历版《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）及地方药材标准记载五灵脂炮制方式多为醋炒。赵佳琛等[4]对五灵脂进行了本草考证，建议对经典名方“身痛逐瘀汤”中五灵脂进行醋炒。醋可引药入肝，增强活血止痛的作用，降低毒性、矫臭矫味等。醋五灵脂炮制工艺多以“取净五灵脂置锅内，用文火加热，微炒后喷淋米醋，炒至微干，有光泽时，取出晾干”描述[5-10]，缺乏详细工艺参数，不利于醋五灵脂饮片质量控制。本研究以米醋用量、电炒锅功率、炒制时间为影响因素设计L9（34）正交试验[11]，以指纹图谱的主成分分析（PCA）结果及外观性状为评价指标，采用综合加权评分优选醋五灵脂的炮制工艺，为其规范炮制及质量控制提供参考。

1 材料

1.1 仪器

H-Class 型超高效液相色谱仪（美国Waters 公司）；XP26 型百万分之一天平、ME204E 型万分之一天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；AR852B+型红外测温仪（东莞万创电子制品有限公司）；H22-X3型电陶炉（杭州九阳生活电器有限公司）；Milli-Q Direct 型超纯水系统（德国默克股份有限公司）；DLSB-5/20B 型低温冷却液循环泵（郑州长城科工贸有限公司）；HWS-28 型电热恒温水浴锅（上海一恒科技仪器有限公司）。

1.2 试药

实验用五灵脂购自陕西省商洛市商州区宽树坪镇，经广东一方制药有限公司魏梅主任药师鉴定为鼯鼠科动物复齿鼯鼠Trogopterus xanthipesMilne-Edwar的干燥粪便。

对照品原儿茶酸（批号：110809-201906，纯度：97.7%）、4-羟基苯甲酸（批号：101149-201903，纯度：100.0%）、槲皮苷（批号：111538-202007，纯度：93.5%）、穗花杉双黄酮（批号：111902-201603，纯度：97.7%）、苯甲酸（批号：100419-201703，纯度：99.9%）均购自中国食品药品检定研究院；对照品扁柏双黄酮（成都瑞芬思生物科技有限公司，批号：RFS-B0511808009，纯度97.0%）；水为超纯水；乙腈、磷酸为色谱纯；其余试剂均为分析纯；米醋佛山市海天调味食品股份有限公司。

2 方法

2.1 醋五灵脂指纹图谱测定方法

2.1.1色谱条件 ACQUⅠTY UPLC HSS T3 色谱柱（150 mm×2.1 mm，1.8 μm）；乙腈（A）-0.1%磷酸（B）梯度洗脱（0～25 min，5%～20%A；25～65 min，20%～60%A；65～68 min，60%～85%A；68～70 min，85%～5%A）；检测波长：265 nm；流速：0.3 mL·min-1；柱温：30 ℃；进样量：2.0 μL。

2.1.2对照品溶液制备 取原儿茶酸、4-羟基苯甲酸、苯甲酸、槲皮苷、穗花杉双黄酮、扁柏双黄酮对照品适量，精密称定，加甲醇溶解制成质量浓度分别为25.793、49.700、41.159、19.112、18.075、48.925 μg·mL-1的混合对照品溶液，即得。

2.1.3供试品溶液制备 取醋五灵脂粉末（过三号筛）约1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80%乙醇50 mL，称定质量，加热回流60 min，放冷，再称定质量，用80%乙醇补足减失的质量，摇匀，用0.22 μm微孔滤膜滤过，即得。

2.2 方法学考察

2.2.1系统适用性试验 取对照品溶液、供试品溶液、空白溶剂适量，按2.1.1项下色谱条件进样测定，在此条件下各组分得到良好分离，供试品溶液超高效液相色谱法（UPLC）图在与对照品溶液UPLC 图相应的保留时间处有相同的色谱峰，且阴性对照无干扰（图1）。

图1 醋五灵脂系统适用性试验UPLC图

2.2.2精密度试验 精密吸取2.1.3项下供试品溶液，按2.1.1项下色谱条件连续测定6次，以4-羟基苯甲酸为参照峰（S），各特征峰相对保留时间和相对峰面积的RSD 分别为0.03%～0.16%、0.25%～3.18%，表明仪器精密度好。

2.2.3重复性试验 精密称取同批次醋五灵脂饮片粉末6 份，按2.1.3项下方法制备供试品溶液，按2.1.1项下色谱条件测定，以4-羟基苯甲酸为参照峰（S），各特征峰相对保留时间和相对峰面积的RSD分别为0.06%～0.31%、0.79%～2.85%，表明该方法重复性良好。

2.2.4稳定性试验 取同一供试品溶液，按2.1.1项下色谱条件分别于0、4、8、12、16、24 h进样检测，以4-羟基苯甲酸为参照峰（S），各特征峰相对保留时间和相对峰面积的RSD 分别为0.05%～0.23%、0.54%～2.77%，表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.3 醋五灵脂炮制工艺正交试验设计

结合《全国中药炮制规范》1988 年版[5]确定醋五灵脂的炮制方法：取净五灵脂100 g置锅中，用文火加热，微炒后喷淋米醋，炒至微干、有光泽时，取出晾干。通过多次预试验并结合实际情况，选定电炒锅功率（A）、米醋用量（B）、炒制时间（C）为考察因素，采用L9（34）进行正交试验，五灵脂药材编号为M，9 次正交试验炮制饮片编号为M1～M9，因素水平见表1。

表1 醋五灵脂炮制工艺正交试验考察因素与水平

2.4 评价方法

2.4.1PCA PCA是考察多个变量间相关性的一种多元统计方法，其利用降维思想，选出较少的几个主成分来揭示多个变量之间的内部关系[12]。本研究以4-羟基苯甲酸为参照峰，其余特征峰的相对峰面积为变量[13]，采用SPSS 21.0 软件进行PCA，根据主成分的特征值、贡献率及碎石图选出主成分。结合载荷矩阵及特征值，按公式（1）计算主成分得分（Gj）。

式中aj为主成分的特征向量，Xj为原始数据标准化值。

按公式（2）计算各主成分综合得分（Kj）。

2.4.2加权综合评分法 为全面客观反映醋五灵脂质量，本研究对外观性状分值及指纹图谱PCA 得分分别赋予权重系数，采用加权综合评分法对各样品进行评价。

外观质量评价依据：《中国药典》1995 年版至2020 年版正文均未收载五灵脂药材，因此笔者参考《全国中药炮制规范》1988 年版[5]对外观形状进行评价，对醋五灵脂的性状以“表面灰褐色或焦褐色，稍有光泽，内面黄褐色或棕褐色。质轻松。略有醋气。”为优，分别以醋五灵脂外表面颜色（H1）、内面颜色（H2）、表面光泽度（H3）、气味（H4）进行评分，各25分，按公式（3）计算外观性状得分（Hi）。

具体评分标准见表2。由于五灵脂与醋五灵脂外观颜色差异不大[5]，光泽度、气味等性状易受环境影响且外观性状评分主要凭借专家及同行的实践经验判断，主观性较强，权重不宜过高，故赋予外观性状评价权重为30%。

表2 醋五灵脂外观性状评分标准

内在质量评价依据：本研究建立的色谱条件共分离出醋五灵脂炮制品中9 个化学成分，其中包括主要酚酸类成分原儿茶酸、4-羟基苯甲酸、苯甲酸。体外实验表明，该组分在抗血小板凝聚、抑菌及镇痛抗炎方面具有较强的生物活性[14]。其中还分离出黄酮类成分穗花杉双黄酮、扁柏双黄酮、槲皮苷，黄酮类成分为醋五灵脂主要有效成分，具有抗炎镇痛、抗病毒、抗血小板凝聚及改善功能性消化不良等作用[15]。对醋五灵脂指纹图谱各色谱峰进行PCA，可集中表征各炮制品主要活性成分的整体变化情况，对醋五灵脂饮片质量控制具有重要意义，因此给予PCA结果权重比为70%。

按公式（4）计算加权综合评分（Y）。

满分为100 分。其中，H=Hj/Hmax，Hi为各外观性状得分，Hmax为外观性状得分最大值；K=Kj/Kmax，Kj为各主成分综合得分，Kmax为主成分综合分析得分最大值[16-17]。

2.4.3KMO 检验和Bartlett′s 球状检验 KMO 检验统计量是用于比较变量间相关性和偏相关性的重要指标，取值为0～1。KMO 统计量越接近于1，变量间的相关性越强，偏相关性越弱，因子分析的效果越好；当KMO 统计量在0.5 以下时，则该数据不宜做PCA 或因子分析[18]。Bartlett′s 球状检验用于检验相关阵中各变量间是否各自独立，若检验结果中P＜0.05，则说明符合标准，数据呈球形分布，各个变量在一定程度上相互独立[19]。

3 结果

3.1 指纹图谱测定结果

按2.3项下方法炮制五灵脂，按2.1项下方法制备供试品溶液并测定指纹图谱，各样品指纹图谱叠加图见图2。以4-羟基苯甲酸为S 峰，计算各特征峰相对峰面积的RSD，见表3。各试验样品相对峰面积的RSD为6.14%～22.13%。

表3 不同炮制工艺醋五灵脂样品共有峰相对峰面积

图2 醋五灵脂炮制样品UPLC指纹图谱叠加图

3.2 KMO检验和Bartlett′s球状检验结果

将各样品特征峰检验值导入SPSS 21.0 软件进行KMO 检验和Bartlett′s 球状检验，KMO 检验值为0.674＞0.5，而Bartlett′s球形检验值为0＜0.05，说明各特征峰存在一定相关性，可进行PCA。

3.3 PCA结果

本研究采用SPSS 21.0 软件进行PCA，因子载荷矩阵见表4，碎石图见图3。以特征值＞1并结合碎石图连续陡峭部分分析，得到2 个主成分[20-21]，特征值分别为5.026、1.442，2 个主成分累积方差贡献率为80.843%，可代表试验数据大部分信息。根据载荷矩阵及特征值，计算得出2 个主成分的特征向量，将其与原始数据标准化相乘后，分别得到主成分得分。按公式（5）计算各主成分综合得分。

图3 醋五灵脂样品PCA碎石图

表4 醋五灵脂样品PCA因子载荷矩阵

G1、G2分别为2 个主成分得分，系数为各成分的方差贡献率。9次试验PCA综合评分见表5。

表5 不同炮制工艺醋五灵脂样品PCA综合评分

3.4 加权综合评分结果

按照2.4项下外观性状评价方法对9组炮制饮片进行性状评分，并结合PCA 结果，以2.4项下加权综合评分法对醋五灵脂正交炮制试验进行最终评分，正交试验设计结果见表6，方差分析见表7。

表6 醋五灵脂L9（34）正交试验结果及直观分析

表7 醋五灵脂L9（34）正交试验结果方差分析

由直观分析可知，醋五灵脂炮制工艺影响因素影响程度由大到小为C＞A＞B，方差分析结果表明，炒制时间对醋五灵脂炮制试验结果影响差异有统计学意义（P＜0.05），而电炒锅功率和米醋用量对结果影响差异无统计学意义。综合分析，确定醋五灵脂最佳炮制工艺为每100 g 五灵脂药材加米醋量为10 g，电炒锅功率为600 W，炒制时间为10 min。

3.5 米醋用量单因素对比试验

为进一步验证工艺的可靠性，分别采用5、10、15、20 g 米醋量进行炮制对比试验。按2.1.3项下方法制备供试品溶液，按2.1.1项下色谱条件进行测定，计算样品的综合评分，结果见表8。在优选的电炒锅功率及炒制时间条件下采用不同米醋量炮制，醋五灵脂饮片PCA 评分差异无统计学意义。用较少的米醋量炮制，醋五灵脂饮片未能达到完全的矫味矫臭效果，而加米醋量多则炒制时喷洒米醋时间长，最终炮制后饮片干爽度、光泽度稍差。

表8 醋五灵脂炮制米醋用量单因素对比试验结果

3.6 验证实验

以优选的醋五灵脂炮制工艺平行制备3 份样品。按2.1.3项下方法制备供试品溶液，按2.1.1项下色谱条件测定，计算3份样品的综合评分，结果见表9。优选的醋五灵脂炮制工艺稳定可靠，重复性好。生五灵脂与优选醋五灵脂饮片见图4。

图4 生五灵脂与优选醋五灵脂饮片

表9 醋五灵脂炮制工艺验证实验结果

4 讨论

4.1 指纹图谱方法考察

本研究建立的色谱条件可有效分离醋五灵脂炮制品中9个化学成分，通过对照品指认出其中6个峰分别为原儿茶酸、4-羟基苯甲酸、苯甲酸、槲皮苷、穗花杉双黄酮、扁柏双黄酮。本研究对不同柱温（28、30、32 ℃）、不同的流速（0.28、0.30、0.32 mL·min-1）、不同比例的提取溶剂（乙醇、50%乙醇、80%乙醇、甲醇、50%甲醇、80%甲醇）、不同的提取方式（超声、回流）及不同的提取时间（15、30、60 min）进行考察。最终确定上述最佳色谱条件。该方法分离度、专属性、重复性良好，可用于醋五灵脂的质量控制。

4.2 炮制对五灵脂成分及功效的影响

五灵脂及醋五灵脂中主要成分为黄酮类、酚酸类等成分，两类成分均具有抗炎镇痛、抗病毒、抑制血小板凝聚等作用[15,22]，与五灵脂的活血止痛、化瘀止血、消积解毒功效具有相关性。对比五灵脂和醋五灵脂的指纹图谱，醋炒后并无化学成分增加或消失。研究发现，五灵脂药材及其炮制品中黄酮类成分峰面积占总峰面积的58.7%～72.0%，其中又以穗花杉双黄酮、扁柏双黄酮峰面积最高。随着电炒锅功率增大、炒制温度升高、受热时间延长，黄酮类成分出现不同程度降低，而酚酸类成分及其余特征峰峰面积增大。

查阅历代本草，清代以来五灵脂炮制方式多为醋炒。《药性切用》中记载“破血生用，调血炒用，入肝醋炒”，说明醋制可引药入肝；同时《伤寒温疫条辨》中记载“酒浸行血，醋炒止血”，表明炒用有止血之功，即醋炒可增强五灵脂活血止痛、化瘀止血的功效[4]。闵凡印[23]指出，五灵脂醋炒后尿素含量降低，在保留原有成分情况下，可去除原药异味。同时醋作为良好的有机溶媒，能增强药物的溶解度从而使有效成分更易煎出，提高疗效[24]。本研究优选的醋五灵脂炮制工艺，以醋五灵脂9 个共有峰的PCA 结果作为内在评价指标，保证了五灵脂原有的活血止痛、化瘀止血、消积解毒等功效，同时炮制的醋五灵脂内外观颜色、光泽度较佳，无腥臭味，醋炒既可协同五灵脂的止血功效又达到了粪便类药材矫味矫臭的目的。

4.3 醋五灵脂炮制工艺的适用性

目前，五灵脂相关炮制研究较少，炮制的依据相对单一。闵凡印[23]针对五灵脂炮制前后尿素和浸出物的变化进行探讨；吴用琼[25]根据患者服药后胃中的受纳舒适度、是否达到矫味矫臭的目的进行研究；而朱志飞等[26]通过单一指标成分原儿茶酸含量确定五灵脂炮制条件。《中国药典》1995 年版至2020 年版正文均未收载五灵脂药材，本研究参照《北京市中药饮片炮制规范》2008 年版[27]文火范围，待锅温升至80～120 ℃时开始炒制计时，最终醋五灵脂饮片出锅温度控制在108～135 ℃，可为醋五灵脂饮片规范炮制及产业化生产提供参考。建立的UPLC 指纹图谱方法，确定了醋五灵脂样品中9个共有峰并对其中6 个色谱峰进行指认，结合PCA 对饮片内在质量进行整体评价。同时选取较直观的色泽、气味等外观性状指标，通过眼观、鼻闻等传统中药鉴别方法进行分析，弥补了单纯以化学指标来判断饮片质量的不足。

综上，本研究建立的醋五灵脂炮制方法将现代理化方法与传统炮制模式相结合，确定的炮制工艺方法重复性好，可为醋五灵脂饮片规范炮制及质量控制提供参考。