利用分子量印迹快速筛选活心丸中蟾蜍二烯酸内酯和二萜生物碱类化合物△

李菡，张珂，廖弈秋，莫尊汇，刘菊妍，宋月林，赵云芳*，宋青青*

1.北京中医药大学 中药学院，北京 100029；

2.广州白云山医药集团股份有限公司 白云山制药总厂，广东 广州 510515；

3.广东省化学药原料与制剂关键技术研究重点实验室，广东 广州 510515；

4.广州医药集团有限公司，广东 广州 510103

活心丸由人参、附子、蟾酥、红花、熊胆、牛黄等10 味中药组成，具有益气活血、温经通脉的功效，临床上广泛地应用于冠心病、心绞痛的治疗[1]。其中，附子和蟾酥为方中兼具药效和毒性的“毒效双性”中药，但相对安全剂量范围比较狭窄。中药的毒性源于所含的毒性成分，现代研究表明附子和蟾酥的毒性成分亦是药效成分[2-3]。附子中的乌头碱、次乌头碱等双酯型二萜生物碱具有较强毒性，炮制后水解生成的苯甲酰乌头原碱、新乌头原碱等单酯型和醇胺型二萜生物碱毒性减弱，且具有强心、抗炎等药理作用[4-5]。蟾酥中蟾蜍二烯酸内酯类化合物如蟾毒灵、脂蟾毒精等，具有抗肿瘤、抗炎、强心等药理作用[6-7]，长期或过量服用蟾酥可出现循环系统、神经系统等中毒症状。目前，活心丸的质量标准仍执行中华人民共和国卫生部药品标准中药成方制剂第十八册[8]（标准文号：WS3-B-3452-98），仅有少数几味药的薄层鉴别，未能对附子中二萜生物碱及蟾酥中蟾蜍二烯酸内酯类成分严格控制，无法全面保证活心丸的质量。因此，阐明活心丸中附子和蟾酥来源的化学成分，既能保证活心丸药效，又能控制其潜在的毒性，是建立活心丸质量控制标准的重要环节。

然而，活心丸中药味多，化学成分复杂，极大地增加了成分分析的难度。近年来，由于超高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱法（UPLC-Q-TOFMS）具备灵敏度高、分析速度快、分辨率高等优势，已被广泛地用于中药等复杂基质中化学成分的快速定性表征研究。然而，采集到的质谱图谱中通常会存在基质中干扰离子、同位素离子、加合离子、多电荷离子等冗余质谱信息，对目标化合物尤其是痕量化合物的图谱解析产生严重干扰。因此，从复杂数据集中有效地挖掘目标化合物的质谱信息已成为快速鉴定的关键。目前，已有较多质谱数据的后处理技术[9]，如分子量印迹（molecular weight imprinting，MWⅠ）[10]、诊断离子过滤（diagnostic fragment ion filtering，DFⅠF）[11]、中性丢失过滤（neutral loss filtering，NLF）[12]和分子网络策略（molecular networking，MN）[13]等。其中，MWⅠ策略仅需将MS1的质荷比信息与已知化合物质谱数据库中数值匹配，即可快速筛选到目标化合物[14]，能够用于活心丸中已知的有毒且有效的二萜生物碱及蟾蜍二烯酸内酯类成分的定性分析。

因此，本研究通过检索PubMed、MassBank 等数据库及相关文献，分别构建源于蟾酥和附子的蟾蜍二烯酸内酯和二萜生物碱类化合物的内部数据库，采用UPLC-Q-TOF-MS 分析活心丸样品，建立MWⅠ后处理策略，快速甄别数据库中已知成分的质谱信号，并结合质谱裂解途径，鉴定其中蟾蜍二烯酸内酯和二萜生物碱类化合物，以期为活心丸的质量控制和临床使用提供依据。

1 材料

1.1 仪器

LC-20AD 系列高效液相色谱（日本岛津公司）串联Triple TOF 6600+型高分辨质谱仪（美国Sciex公司）；ME204 5424 型电子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；UP2200H型超声波清洗器（南京垒君达超声电子设备公司）；5424R 型离心机（德国艾本德公司）；Milli-Q 型超纯水系统（美国密理博公司）。

1.2 试药

6批活心丸样品（批号分别为1190001、1190002、1190003、1170001、1170002、1170003）由广州白云山医药集团股份有限公司白云山制药总厂药物研究所提供，样本存放于北京中医药大学中药现代研究中心。

对照品蟾毒灵（批号：DT210830-022）、蟾毒它灵（批号：DST200811-079）、酯蟾毒配基（批号：DST200816-063）和华蟾毒精（批号：DST200205-005）均购自成都德思特生物技术有限公司；新乌头碱（批号：2614/12516）、次乌头碱（批号：2615/12516）、苯甲酰新乌头原碱（批号：2316/12313）和苯甲酰次乌头原碱（批号：2317/12312）均购自上海诗丹德生物科技有限公司。以上对照品经高效液相色谱-二极管阵列检测器法（HPLC-DAD）检测，纯度均大于98%。

质谱级甲酸和乙腈（美国Thermo-Fisher 公司）；去离子水为实验室自制超纯水（18.2 MΩ‧cm）；分析纯甲醇（北京化工厂有限责任公司）。

2 方法

2.1 样品制备

2.1.1对照品溶液的制备 取各对照品适量，精密称定，加甲醇溶解，配制成对照品储备液。精准吸取各对照品适量，分别用甲醇稀释成质量浓度为10 μg·mL-1的对照品溶液。

2.1.2供试品溶液的制备 称取各批次活心丸样品适量，分别置于研钵中研磨粉碎，过二号筛，得到活心丸粉末。精密称取各批粉末样品10 mg于1.5 mL离心管中，加入甲醇0.5 mL 超声提取30 min，随后在12 000 r·min-1离心10 min（离心半径为5 cm），等量吸取各批次上清液，混合均匀，即得供试品溶液。

2.2 UPLC-Q-TOF-MS分析条件

Capcell Core ADME 色谱柱（150 mm×2.1 mm，2.7 µm）；流动相为0.1%甲酸水（A）和乙腈（B），流速为0.2 mL‧min-1；梯度洗脱（0～5.0 min，5%～17%B；5.0～7.0 min，17%～35%B；7.0～27.0 min，35%～55%B；27.0～30.0 min，55%～95%B；30.0～30.1 min，95%～5%B；30.1～34.0 min，5%B）；柱温为35 °C；进样量为2 μL。

Triple TOF 6600+型质谱仪配备电喷雾离子源（ESⅠ），正离子模式采集，源参数设置如下：气帘气（CUR）压力为35 psi（1 psi=6.895 kPa），雾化气（GS1）压力为55 psi，辅助气（GS2）压力为55 psi，喷雾电压（ⅠS）为5500 V；离子化温度（TEM）为550 °C。采用实时动态背景扣除（DBS）和数据依赖型采集模式（ⅠDA）采集MS2，MS1及MS2采集范围均为m/z50～1000，碰撞能量（CE）为40 eV，碰撞能扩展值（CES）为±20 eV。使用PeakView™ 1.2（美国Sciex 公司）进行后续色谱峰提取和识别等数据处理。

2.3 数据后处理

2.3.1蟾蜍二烯酸内酯和二萜生物碱类化合物数据库的构建 基于文献[15-20]已报道的分别来源于蟾酥和附子的蟾蜍二烯酸内酯和二萜生物碱类化合物，以 及 ChemSpider（http://www.chemspider.com）、HMDB（https://hmdb.ca）、PubChem（http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）、SciFinder（https://scifinder.cas.org/scifinder）和Chemical Book（https://www.chemicalbook.com/ProductⅠndex.aspx）数据库中信息，建立了包括蟾蜍二烯酸内酯和二萜生物碱类化合物名称、结构、分子式、准分子离子（[M+H]+）的质荷比和碎片离子信息的内部数据库。

2.3.2建立MWⅠ筛选方法 使用PeakView™ 1.2软件提取活心丸的一级总离子流（TⅠC）图，导出有效洗脱时间（1.0～30.0 min）内且响应阈值高于0.1%的MS1质谱数据。以采集的MS1质荷比的整数部分作为X轴，小数部分作为Y轴，将质谱数据导入GraphPad Prism 7.0 软件绘制活心丸MS1数据的二维散点图。同理，参照内部数据库中化合物准分子离子的质荷比信息，且小数部分允许误差范围为±0.005，绘制已知的蟾蜍二烯酸内酯和二萜生物碱类化合物的二维散点图。

3 结果

3.1 基于MWⅠ的蟾蜍二烯酸内酯与二萜生物碱的快速筛选

通过查阅蟾酥与附子化学成分相关文献，结合开源化合物数据库中的化合物信息，最终建立囊括165 个化合物的内部数据库，其中蟾蜍二烯酸内酯类化合物59 个，二萜生物碱类化合物106 个。由于这2 类化合物存在同分异构体，其准分子离子的质荷比相同，MWⅠ信号无法区分，故已知化合物的二维散点图中包含98 个分子量印迹信号（图1A）。其中27个蟾蜍二烯酸内酯类（蓝色）及71个二萜生物碱类（绿色）化合物。

图1 基于分子量印迹技术的二维散点图

采用UPLC-Q-TOF-MS 分析活心丸样品，得到MS1TⅠC图（图2）。选取保留时间1.0～30.0 min内的11 442 个质谱信号，建立活心丸MS1数据二维散点图（图1B）。

图2 活心丸UPLC-Q-TOF-MS一级TIC图

将活心丸的二维散点图与已知化合物的二维散点图重叠，在98 个目标分子量印迹信号±0.005 的误差范围内，捕获到活心丸MS1数据中485 个m/z[M+H]+信号（图1C）。由于一个化合物的色谱峰宽内会采集到多个MS1信号，以色谱峰峰宽（0.11～0.20 min）及保留时间，过滤掉采集到的tRMS1数据中同一色谱峰中的重复的MS1信号，最终共筛选到内部数据库中80 个已知化合物，包括47个蟾蜍二烯酸内酯类和33 个二萜生物碱类化合物，详细信息见表1。

表1 活心丸中蟾蜍二烯酸内酯及二萜生物碱类化学成分的鉴定结果

续表1

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3.2 蟾蜍二烯酸内酯类化合物的结构鉴定及质谱裂解途径

基于MWⅠ策略，从活心丸中初步筛选得到来源于蟾酥的47 个蟾蜍二烯酸内酯类化合物，其中包括蟾毒配基类化合物38 个（化合物19、21～23、26～28、31、34、36、38、39、41～43、46、50、51、53、56、58、59、61、62、64～70、72、74、76～80）和脂肪酸氨基酸酯类蟾蜍毒素9 个（化合物29、32、37、45、47、52、60、73、75）。经对照品比对，准确鉴定了其中4 个蟾毒配基类化合物（蟾毒它灵、蟾毒灵、华蟾毒精和酯蟾毒配基，分别为化合物68、76、77和78）。通过对以上4个对照品的质谱数据进行分析（表2），并结合文献研究，总结和归纳了该类化合物的裂解规律。在正离子模式下，准分子离子通常以[M+H]+的形式存在，结构中多存在羟基取代，前体离子会中性丢失水分子（H2O，m/z18.010 6）生成[M+H-H2O]+等相应碎片离子。其中蟾毒配基类C17位不饱和内酯环可能发生裂解，中性丢 失H2O 和CO（m/z27.994 9），产 生[M+H-2H2O]+、[M+H-2H2O-CO]+等碎片离子[15-17]。化合物C16位存在乙酰基取代时，如蟾毒它灵、华蟾毒精等，酯键易发生断裂，中性丢失乙酸分子（CH3COOH，m/z60.021 1），产生[M+H-CH3COOH]+、[M+HCH3COOH-H2O]+和[M+H-CH3COOH-H2O-CO]+等碎片离子。此外，C17位还可以丢失六元不饱和内酯 环（C5H4O2，m/z96.021 1），产 生[M+H -C5H4O2]+等碎片离子。蟾蜍毒素类化合物母核C3位与酸成酯，且筛选到的9 个脂肪酸氨基酸酯类蟾蜍毒素均可断裂酯键，产生相应的辛二酰精氨酸（m/z331.198 1）、己二酰精氨酸（m/z303.166 8）或丁二酰精氨酸（m/z275.135 5）等特征性碎片离子。

表2 蟾毒配基类和二萜生物碱类化合物对照品高分辨质谱信息

以蟾毒配基类化合物26（tR=10.59 min）为例，对蟾蜍二烯酸内酯类化合物进行结构鉴定。在正离子模式下，MS1图谱显示其准分子离子峰[M+H]+为m/z403.248 0，预测其分子式为C24H34O5（误差为0.2×10-6），可能为内部数据库中蟾毒配基类化合物远华蟾毒精（telocinobufagin）或其同分异构体。MS2图谱中主要检测到的碎片离子为m/z385.239 2、367.228 6、349.217 4、339.232 1、321.220 4、271.206 5和253.196 1（图3A），推测准分子离子分别中性丢失1、2、3 分子的H2O 产生碎片离子m/z385.239 2[M+H-H2O]+、367.228 6[M+H-2H2O]+和349.217 4[M+H-3H2O]+，碎片离子m/z367.228 6和349.217 4 继而碎裂C17位不饱和内酯环，脱去羰基（CO）分别产生碎片离子m/z339.232 1[M+H-2H2O-CO]+和321.220 4[M+H-3H2O-CO]+；m/z367.228 6 和349.217 4 也可失去C17位不饱和内酯环（C5H4O2），生成m/z271.206 5[M+H-2H2O-C5H4O2]+和253.196 1[M+H-3H2O-C5H4O2]+（图3B）。根据质谱裂解途径的推断及碎片离子归属，并与内部数据库中MS2信息比对，该化合物可能为远华蟾毒精或其同分异构体。

图3 远华蟾毒精的二级质谱图及质谱裂解途径

3.3 二萜生物碱类化合物的结构鉴定及质谱裂解途径

从活心丸中初步筛选到来源于附子的33 个二萜生物碱类化合物，包括C19 型二萜生物碱29 个，其中7 个双酯型（化合物40、44、49、54、57、63、71），11 个单酯型（化合物16～18、20、24、25、30、33、35、48、55），11 个醇胺型（化合物1～6、8～11、13），C20 型二萜生物碱1 个（化合物7），以及其他型二萜生物碱3 个（化合物12、14、15）。经对照品比对，准确鉴定了其中4 个二萜生物碱类化合物（苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、新乌头碱和次乌头碱，分别为化合物25、35、49、63）。分析以上4个对照品的质谱数据（表2），并结合文献研究，总结和归纳了该类化合物的裂解规律。二萜生物碱母核结构上均有甲氧基和羟基取代，常以中性丢失H2O 和CH3OH 为主要裂解方式，产生[M+H-H2O-CH3OH]+和[M+H-CH3OH]+等碎片离子[18-19]。新乌头碱和次乌头碱等双酯型生物碱相比于单酯型生物碱在C8位有乙酰基取代，能够特征性地丢失CH3COOH，产生[M+H-CH3COOH]+、[M+HCH3COOH-CH3OH]+等碎片离子；而苯甲酰新乌头原碱和苯甲酰次乌头原碱等单酯型生物碱的C8位无乙酰基取代，常中性丢失CH3OH 和H2O，产生[M+H-H2O-2CH3OH]+、[M+H-2CH3OH]+等碎片离子。虽然双酯型与单酯型二萜生物碱在C14位有苯甲酰基取代，但C14位苯甲酰基不容易丢失[20]。此外，醇胺型生物碱C8位无乙酰基取代且C14位无苯甲酰基取代，常以中性丢失CH3OH 和H2O 为主要裂解方式。因此，C19 型二萜生物碱的质谱裂解规律基本相似。

以C19型醇胺型二萜生物碱化合物3（tR=6.39 min）为例鉴定其结构。正离子模式下其准分子离子峰[M+H]+为m/z486.268 6，预测其分子式为C24H39NO9（误差为-2.4×10-6），经MWⅠ筛选后可知化合物3可能为新乌头原碱（mesaconine）。MS2图谱中主要碎片离子有m/z468.257 5、454.239 2、436.233 6、422.233 6、404.205 5 和372.177 5（图4A）。准分子离子可中性丢失H2O 生成碎片离子m/z468.257 5[M+H-H2O]+，继而脱去1个分子和2个分子CH3OH分别产生碎片离子m/z436.233 6[M+H-H2OCH3OH]+和404.205 5[M+H-H2O-2CH3OH]+；准分子离子也可直接丢失1分子和2分子CH3OH，分别产生碎片离子m/z454.239 2[M+H-CH3OH]+和422.233 6[M+H-2CH3OH]+，m/z422.233 6可相继脱去CH3OH和H2O 产生碎片离子m/z372.177 5[M+H-H2O-3CH3OH]+（图4B）。该化合物的MS2信息与内部数据库中新乌头原碱的碎片离子一致，且通过质谱裂解途径推断结构，鉴定该化合物为新乌头原碱。

图4 新乌头胺的二级质谱图及质谱裂解途径

4 讨论

活心丸化学成分复杂，处方蟾酥中的蟾蜍二烯酸内酯和附子中二萜生物碱类既是药效成分也为潜在的毒性成分，为保证活心丸的安全性及有效性，快速表征其化学组成能够为活心丸质量控制及药效物质的阐明提供依据。本研究采用UPLC-Q-TOFMS，采集活心丸样品完整的质谱信息，建立MWⅠ后处理策略，利用所构建的蟾蜍二烯酸内酯类和二萜生物碱类化合物数据库，快速甄别已知蟾蜍二烯酸内酯类化合物47 个，二萜生物碱类化合物33 个，结合分子式预测、质谱裂解途径及碎片离子归属，鉴定筛选化合物结构。由于活心丸处方以附子的炮制品黑顺片入药，炮制后附子毒性成分双酯型生物碱水解，含量显著降低，故从样品中仅筛选到7 个双酯型二萜生物碱，其余26 个为单酯型及醇胺型二萜生物碱。鲜蟾酥中主要成分为蟾蜍毒素类化合物，而活心丸制剂中入药为干蟾酥，鲜蟾酥在高温炮制后蟾蜍毒素类化合物大部分会分解为蟾毒配基类化合物，故在活心丸中检出大量蟾毒配基类化合物，仅筛选到已知的9个蟾蜍毒素类化合物，均为脂肪酸氨基酸酯类。因此，单酯型、醇胺型二萜生物碱及蟾毒配基类化合物能够作为质量控制指标性成分，用于全面评价活心丸质量，确保其安全有效。

活心丸化学成分复杂，UPLC-Q-TOF-MS 能够快速全面地采集其化学成分信息，但质谱数据集的解析工作尤为繁重，尤其是从大量数据中选择性筛查某一类成分时，需要借助后处理策略才能实现。本研究针对其中入药量较低的蟾酥与附子，建立蟾蜍二烯酸内酯和二萜生物碱类成分数据库，且利用MWⅠ策略，能够有效地过滤掉大量的冗杂信息。活心丸中二萜生物碱结构含有1 个氮原子，精确分子量的整数部分为偶数，而蟾蜍二烯酸内酯类化合物不含或含有偶数个氮原子，精确分子量的整数部分为奇数，在建立MWⅠ方法时，针对分子量特点，不仅能通过MS1质谱信号快速匹配已知成分，而且在鉴定过程中也能够对成分来源进行区分。由于二萜生物碱类和蟾蜍二烯酸内酯类结构中羟基等取代基位置不同，各类化合物的同分异构体较多，虽然色谱能够对同分异构体实现一定程度的分离，但在缺乏对照品的情况下，仅通过MWⅠ筛选与碎片离子归属，尚不能精准鉴定和区分同分异构体的结构。保留时间能够反映化合物的极性，进而反映其结构信息，因此，后期可建立定量结构保留关系（QSRR）[21]，寻找这2 类化学成分的结构与在反相色谱中保留时间的关系，准确指认同分异构体的色谱峰。也可通过在线能量分辨质谱策略（online ERMS）[22]，建立裂解所需碰撞能与结构中化学键键能的相关性，辨别同分异构体结构。

在常用的质谱数据后处理技术中，DFⅠF 和MN等基于二级碎片离子信息挖掘目标及未知化学成分。DFⅠF 能够筛查到具有相同诊断离子的结构类似物，以诊断离子进行印迹筛选，类似于本研究基于一级离子的MWⅠ策略。UNⅠFⅠ天然产物解析平台广泛用于复杂天然产物样品的成分鉴定工作中[23]，该平台虽目前只能用于解析Waters Q-TOF 的质谱数据，但其快速鉴定的实质也是将MWⅠ及DFⅠF 策略应用到自动解析过程中，对数据与软件数据库中化合物的一级和二级信息进行印迹筛选。MN 基于二级质谱碎片的相似度建立化学成分可视化的网络图谱，从而推断未知化合物信息，能够与本研究的MWⅠ筛选已知化合物的方法相结合，提高基于质谱技术鉴定天然产物的能力与效率。

综上分析，本研究为快速筛选中药等复杂基质中已知成分提供了思路和方法，也为进一步研究活心丸的药效物质及临床安全使用提供了依据。