褪黑素处理对小青菜贮藏品质的影响

卢瑞雪，韩延超，陈杭君，房祥军，吴伟杰，刘瑞玲，穆宏磊，郜海燕

（浙江省农业科学院食品科学研究所 农业农村部果品产后处理重点实验室浙江省果蔬保鲜与加工技术研究重点实验室 中国轻工业果蔬保鲜与加工重点实验室 杭州 310021）

小青菜属于白菜的一个亚种，又称小白菜、小油菜等，是易腐性绿叶蔬菜的代表，采后2 d 开始变黄，常温贮藏时间极短。目前大多采用低温、气调等方法贮藏，然而设备费用高[1]。近些年，绿色蔬菜的摄入量与食品安全性越来越受到重视，而褪黑素是所有植物都具有的一种内源吲哚胺，其安全性毋庸置疑。关于小青菜的保鲜，有低温、气调冷库、涂膜保鲜等。徐静等[2]研究表明，将小青菜于0.1%植酸、20 mg/L 细胞分裂素中浸泡，可延长其贮藏时间。袁海娜等[3]发现热水处理小青菜可延长贮藏时间。沈连清等[4]研究表明，气调包装可延长小青菜的贮藏期。

褪黑素（Melatonin，MT）是生物体可自身合成的一种化合物，在体内可代谢，因此不会在体内蓄积，褪黑素存在于许多常见的水果和蔬菜中，如番茄、苹果、草莓等[5-6]。植物的生长[7]和衰老[8]等离不开褪黑素，植物的生长调节、自由基清除[9]等也离不开褪黑素。Tan 等[10]发现MT 通过抑制ABFs 介导的脱落酸生物合成和叶绿素降解，延缓菜心叶片衰老。1 mmol/L 褪黑素可延缓大麦叶片叶绿素降解[11]。吴燕等[12]发现外源MT 能增强栝楼雌花抗氧化酶活性等。王蓉等[13]研究发现MT 可延缓栀子叶片衰老。Gao 等[14]研究表明，MT 可减慢桃果实采后衰老。高帆等[15]研究表明，施加MT 能有效提高猕猴桃幼苗抗氧化能力。有研究表明从食物中摄入植物中的褪黑素在一定程度上可以预防阿尔茨海默病[16]，由此可见其安全性是毋庸置疑的。将褪黑素用于小青菜保鲜，尚未见报道。因此，本试验拟通过研究不同MT 处理对小青菜的色泽、失重率、黄化率以及叶绿素、维生素C、糖酸、抗氧化酶活含量的影响，筛选出保鲜效果较合适的MT 处理浓度，为延长小青菜采后贮藏期提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

本文选用‘上海青’品种小青菜为试验材料，2019年4月购买自江苏省南通市通州湾蔬菜基地。小青菜按照新鲜、大小均一、无机械损伤、无病虫害[17]等要求挑选。

试剂：丙酮、三氯乙酸、抗坏血酸、酒石酸钾钠、氢氧化钠、3.5-二硝基水杨酸、结晶酚、冰醋酸、无水醋酸钠、亚硫酸钠、葡萄糖、聚乙二醇6000、聚乙烯吡咯烷酮、TritonX-100、愈创木酚、无水乙醇、过氧化氢、磷酸、邻苯二酚、褪黑素，上海生工生物工程股份有限公司。

1.2 仪器与设备

R-400 手持色差仪，日本SEMSING；5430 R台式高速离心机，德国Eppendorf 生命科学公司；Spark 多功能酶标仪，瑞士Tecan 公司；877 Metrohm 自动电位滴定仪，瑞士万通公司；LB20T糖度计，广州市速为电子科技有限公司。

1.3 试验方法

小青菜在处理前在自来水中漂洗，去除杂质等。将小青菜分别用0.2，0.4，0.6，0.8 mmol/L 褪黑素浸泡3 min，对照组采用同体积清水浸泡，室温晾干。为模拟小青菜采后贮藏条件，选择60 颗小青菜，用PE 袋（0.06 mm）进行包装，每袋4 颗小青菜，20 ℃恒温箱贮藏，间隔2 d 取样，测定小青菜品质指标。

1.4 品质指标测定

色泽的测定：采用CR-400 手持色差仪。

失重率的测定：采用称重法。

失重率（%）=（小青菜的初始质量-小青菜贮藏一段时间后的质量）/小青菜的初始质量×100

黄化率的测定：参考徐静等[2]方法，根据小青菜叶片黄化面积划分为5 级。

0 级，无黄化；1 级，S黄化＜10%；2 级，10%＜S黄化＜25%；3 级，25%＜S黄化＜40%；4 级，S黄化＞40%，公式如下：

黄化指数=∑（黄化级别×该级别叶片数）/调查总叶片数

维生素C 含量的测定：采用韩延超等[18]测定方法。

叶绿素含量的测定：采用曹建康等[19]测定方法。

可溶性固形物的测定：采用便携式阿贝折光仪测量。

还原糖含量：采用3，5-二硝基水杨酸法[19]。

过氧化物酶（POD）活性测定：采用愈创木酚法测定[19]。

多酚氧化酶（PPO）活性测定：采用比色法测定[19]。

1.5 数据处理

GraphPad Prism 5 进行数据处理和绘图，SPSS 22.0 中的邓肯多重比较进行显著性差异分析，P<0.05 表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 褪黑素对小青菜色泽的影响

L*值代表小青菜亮度，L*值越大表明颜色越亮。小青菜叶绿素降解导致黄化，因此小青菜叶片L*值呈不断上升的趋势。由图1a 可知，第6 天开始，0.2，0.4，0.6 mmol/L MT 处理组延缓了L*值上升，并且与对照组之间具有显著差异（P<0.05）。其中，0.6 mmol/L MT 处理组L*值比对照组和0.2，0.4，0.8 mmol/L 处理组低，L*值最低。

图1 不同浓度褪黑素对小青菜色泽的影响Fig.1 Effects of different concentrations of melatonin on color of Brassica chinensis L.

a*值表示小青菜红绿水平，负值小表示叶片呈绿色强。由图1b 可知，小青菜a*值持续上升，说明小青菜叶片绿色在减弱。对照组的a*值一直高于褪黑素处理组，且对照组与0.2，0.4，0.6 mmol/L MT 处理组差异显著（P < 0.05），其中0.6 mmol/L MT 处理组a*值上升最为缓慢。说明0.6 mmol/L MT 能有效延缓a*值上升。

b*值代表小青菜的蓝黄水平，数值大表示小青菜叶片黄化严重。由图1c 可知，b*值总体呈上升趋势。贮藏第4 天后，0.4，0.6 mmol/L MT 处理组与对照组差异显著（P<0.05），延缓了b*值上升，而0.6 mmol/L MT 处理组的b*值总体偏低，说明浓度为0.6 mmol/L 的褪黑素处理组效果较好，可延缓b*值上升。

2.2 褪黑素对小青菜失重率的影响

叶类蔬菜贮藏品质可体现在失重率的高低。由图2可知，失重率总体呈上升状态。其中，0.6 mmol/L MT 处理组的失重率显著低于对照组和0.2，0.4，0.8 mmol/L MT 处理组，贮藏期间0.6 mmol/L MT 处理组的失重率上升最平缓，失重率最低。第8 天时，0.2 mmol/L 和0.4 mmol/L MT 处理组之间差异不显著，而0.2 mmol/L 和0.4 mmol/L MT 处理组与对照组和0.6，0.8 mmol/L 处理组差异显著（P<0.05）。说明0.6 mmol/L MT 处理能有效控制新鲜小青菜在采后贮藏过程中水分的丧失。

图2 不同浓度褪黑素对小青菜的失重率的影响Fig.2 Effects of different concentrations of melatonin on weight loss rate of Brassica chinensis L.

2.3 褪黑素对小青菜黄化率和叶绿素的影响

黄化率可以衡量绿色蔬菜品质。由图3a 可知，贮藏期间，黄化率呈上升趋势，不同浓度褪黑素处理后黄化率变化不同。在这些处理组中，0.6 mmol/L MT 处理组黄化率上升最为缓慢，且黄化率最低，显著低于其它处理组。这说明0.6 mmol/L MT 处理可有效延缓其黄化速率，延长食用期。

由图3b 可知，小青菜叶绿素含量不断下降。随着贮藏时间的延长，0.2，0.4，0.6，0.8 mmol/L MT处理组的小青菜叶绿素含量都显著高于对照组（P<0.05），贮藏第8 天，0.2，0.4，0.6，0.8 mmol/L 处理组叶绿素含量分别为0.24953，0.3989，0.56884，0.31264 mg/g，分别下降至初始值的16.64%，26.59%，37.92%，20.84%，说明不同浓度褪黑素处理组均能不同程度抑制叶绿素的降解。其中0.6 mmol/L MT 处理组的小青菜叶绿素含量相对较高。

图3 不同浓度褪黑素对小青菜的黄化率和叶绿素的影响Fig.3 Effects of different concentrations of melatonin on yellowing rate and chlorophyll content of Brassica chinensis L.

2.4 褪黑素对小青菜维生素C 的影响

由图4可知，贮藏期间，小青菜VC 含量不断下降。0.2，0.4，0.6，0.8 mmol/L MT 处理组的小青菜叶绿素含量都显著高于对照组（P ＜0.05）。0.4 mmol/L MT 处理组贮藏第8 天下降至初始值的72.41%，0.8 mmol/L MT 处理组贮藏第8 天下降至初始值的58.62%。相比之下，0.6 mmol/L MT 条件下VC 含量下降的最缓慢，贮藏第8 天下降至初始值的83.45%。可见，褪黑素处理VC 含量高于对照组，其中褪黑素浓度为0.6 mmol/L 的处理组效果较明显。

图4 不同浓度褪黑素对小青菜的维生素C 的影响Fig.4 Effects of different concentrations of melatonin on vitamin C content of Brassica chinensis L.

2.5 褪黑素对小青菜可溶性固形物和还原糖的影响

可溶性固形物（Total soluble solid，TSS）主要是糖、矿物盐类、色素等可溶于水的物质，可反映蔬菜采后品质的变化。由图5a 可知，TSS 连续下降。2～4 d 可溶性固形物下降较明显，第6 天开始下降相对较缓慢，对照组和0.8 mmol/L MT 可溶性固形物下降最为迅速，然而褪黑素浓度为0.6 mmol/L 的处理组变化最迟缓。

由图5b 可知，贮藏第2 天还原糖含量均开始降低，这是由于小青菜贮藏期间进行呼吸代谢，消耗糖类物质。对照组还原糖含量由贮藏前的0.69%降至贮藏结束时的0.20%，而0.6 mmol/L MT 处理组则由0.69%降至贮藏结束时的0.28%。在整个贮藏过程中，0.6 mmol/L MT 处理组还原糖含量显著高于0.2，0.4，0.8 mmol/L MT 处理组与对照组（P ＜0.05），表明0.6 mmol/L MT 处理减缓还原糖的降解效果较好。

图5 不同浓度褪黑素对小青菜可溶性固形物和还原糖的影响Fig.5 Effects of different concentrations of melatonin on TSS and reducing sugar of Brassica chinensis L.

2.6 褪黑素对小青菜抗氧化酶活性的影响

过氧化物酶（POD）可以反映小青菜组织老化的程度，可减少小青菜中自由基的蓄积[20]。由图6a可知，POD 在贮藏0～4 d 时上升缓慢，4～8 d 上升明显。0.2，0.4，0.6 mmol/L 褪黑素处理组POD 活性均高于对照组。其中，0.6 mmol/L MT 处理组与对照组之间始终具有显著性差异（P ＜0.05）。贮藏末期，0.6 mmol/L MT 处理组POD 活性是初期的1.34 倍，贮藏末期对照组POD 活性是初期的1.59倍。表明在小青菜贮藏过程中的衰老与POD 存在一定关系，0.6 mmol/L MT 处理在一定程度上延缓了小青菜的衰老。

多酚氧化酶（PPO）是一种关键的氧化酶[21]，小青菜的黄化与PPO 有关[22]。由图6b 可知，PPO 活性不断上升。MT 处理后PPO 活性不低于对照组。对照组的PPO 活性在第8 天时是贮藏初期的4.10 倍；0.6 mmol/L MT 处理组在第8 天达到活性高峰，贮藏结束时PPO 活性是贮藏初期的3.30倍；贮藏8 d 时，0.6 mmol/L MT 处理组PPO 活性是对照组的1.24 倍。0.6 mmol/L MT 处理PPO 活性最高并且与对照组差异显著（P ＜0.05）。小青菜贮藏过程中的衰老与PPO 存在一定关系，通过激活PPO 活性，能够在一定水平上延迟小青菜的衰老进程，其中0.6 mmol/L MT 效果较好。

图6 褪黑素对小青菜POD 和PPO 的影响Fig.6 Effects of melatonin on POD and PPO activity of Brassica chinensis L.

3 讨论与结论

绿叶蔬菜色泽变化与黄化率和叶绿素含量密切相关。有报道外源MT 可减慢叶片[23]、青花菜[24]、小麦叶片[25]叶绿素的降解。本研究选用褪黑素浸泡采后小青菜，在室温条件下贮藏。与对照组相比，0.6 mmol/L 的MT 处理能够保持相对较好的色泽，延缓了黄化的发生以及叶绿素含量的减少，维持小青菜较好的外观品质，显著延缓小青菜的衰老。Tan 等[26]使用100 μmol/L 的MT 浸泡菜心延缓了叶绿素的降解。贾志伟等[27]采用100 mg/L 的MT处理菜心，第9 天时处理组叶绿素含量是对照组的2.08 倍。范海霞等[28]用200 μmol/L 的MT 处理牡丹幼苗叶片发现可提高光合色素含量。Ahmad 等[29]用100 μmol/L 的MT 喷施玉米苗，叶绿素含量提高80.4%。本研究褪黑素浓度处理稍高于一部分研究，分析可能是因为有些试验材料为水培，叶片较为脆嫩，耐受性较低，所以褪黑素处理浓度低，而本研究的小青菜为土培，耐受性较水培大，所以褪黑素处理浓度稍高一些，然而也有与本研究浓度相似的，蒲玉瑾等[30]发现600 μmol/L 外源MT 处理降香黄檀幼苗总叶绿素含量最高，促进生长效果最佳。综合分析，蔬菜保鲜的褪黑素溶液浓度大致范围为100～600 μmol/L。

小青菜含有70%～90%的水分，鲜嫩可口，含多种营养素，如维生素C、矿物质、糖、有机酸、粗纤维等，其中蔬菜供应人体摄入维生素C 的90%。Zahed 等[31]每周喷施褪黑素对草莓果实的可溶性固形物、总酸度、维生素C 和糖类都有较好的影响；Miao 等[32]采用褪黑素处理西兰花，维持了较高的维生素C 含量。新鲜切好的西兰花用褪黑素溶液浸泡也显著提高了抗坏血酸含量[33]。本研究也得到了相似的结果，褪黑素处理使其保持了较高水平的TSS、还原糖和VC 含量，使小青菜营养品质较好。

除此之外，MT 激活了POD 和PPO，这与Li等[34]采用MT 处理茶树叶片时，发现MT 处理也显著提高超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和过氧化物酶的活性来提高其抗氧化能力的研究结果相类似。张俊康等[35]喷施外源MT 可显著提高软枣猕猴桃的抗氧化酶活性与本研究得到了相似结果。Liang 等[36]采用褪黑素处理猕猴桃，发现MT 在保护猕猴桃的抗氧化系统方面效果显著。Shang 等[37]发现褪黑素处理还可显著促进蓝莓中抗氧化酶的活性。贾乐等[38]发现褪黑素处理可保持香菇较好的贮藏品质，降低活性氧代谢产物生成速率，提高机体的抗氧化能力。对于常温贮藏小青菜叶绿素降解途径中的一些酶及其代谢产物还未探索，有待深入研究。本研究结果为今后在小青菜采后贮藏保鲜过程中褪黑素浓度的选择与设计提供了参考。