基于网络药理学探索血府逐瘀汤治疗非小细胞肺癌的作用机制

田 琳，毕胜男，陈梦竹，牛崇阳，齐文龙，王 檀

长春中医药大学附属医院，吉林 长春 130021

原发性肺癌是我国常见的恶性肿瘤之一，而非小细胞肺癌(non-small-cell lung carcinoma，NSCLC)是其最常见的类型，约占肺癌总数的85%，具有恶性程度高、分化程度低、生长较快的特点，如不及时治疗，5 年生存率低于15%［1-2］；目前临床治疗以化疗、放疗、免疫治疗、介入和中医药治疗为主。其中手术治疗是早期NSCLC 的首选方法，但大多数NSCLC 确诊时已是中晚期，失去了外科手术的机会，临床常用EP 方案化疗，但放化疗对人体毒副反应大，适应症少。近年来随着中医药治疗恶性肿瘤疾病研究的不断深入，中医辨证治疗癌症取得了理想效果，使得临床治疗恶性肿瘤有了新选择［3］。

中医治疗NSCLC 强调辨证治疗、标本兼治。瘀阻肺络证为肺癌的常见分型，非小细胞肺癌患者多气血亏虚，治疗常以补气活血、祛瘀止痛、化痰散结为治则。血府逐瘀汤出自《医林改错》，由桃仁、红花、当归、生地黄、川芎、赤芍、牛膝、桔梗、柴胡、枳壳、甘草组成，具有活血化瘀、行气止痛等功效，对治疗瘀阻肺络型肺癌有一定疗效，目前临床有很多关于血府逐瘀汤治疗NSCLC 的报道，如张红等［4］选取80 例NSCLC 患者为研究对象，使用血府逐瘀汤进行治疗，结果缓解33例，稳定41例，进展6 例，总有效率41.25%。张喜峰等［5］选取52例NSCLC 患者为研究对象，使用血府逐瘀汤进行治疗，结果缓解率为75.00%，可见，血府逐瘀汤能提高NSCLC 患者肺功能，对改善中医证候具有临床价值。血府逐瘀汤成分复杂多样，其对NSCLC的治疗作用机制目前尚无明确研究报道。

网络药理学是近年来新兴的一门学科，融合了系统生物学、多向药理学、计算生物学、网络分析等多学科技术和内容，将生物学网络与药物作用网络整合，探究疾病及药物的相互作用机理，与复杂疾病的治疗理念相吻合［6］，通过对信号通路的多途径调节，提高药物疗效，降低药物毒副作用，以此提升新药临床试验的成功率，节省药物研发费用。本研究运用网络药理学方法，获取血府逐瘀汤治疗NSCLC 的主要药物成分及活性靶点，建立相关网络，分析血府逐瘀汤治疗NSCLC 的作用机制，为临床使用血府逐瘀汤提供数据支持。

1 资料与方法

1.1 文献检索利用“CNKI、万方”等数据库的高级检索，以“血府逐瘀汤+肺癌、血府逐瘀汤＋非小细胞肺癌、网络药理学”为关键词，以中医学、中药学、中西医结合为文献检索范围，检索时间不限。

1.2 数据库与分析软件基因表达数据库（gene expression omnibus，GEO，美国国立生物技术信息中心NCBI创建并维护的基因表达数据库）、中药系统药理学数据库和分析平台（简称TCMSP，网址：http：//tcmspw.com/tcmsp.php）、Practical Extraction and Report Language（Perl）软件、R语言的Bioconductor 库、Cytoscape v3.6.0 软件、CytoNCA安装包等数据库和软件。

1.3 基因芯片的筛选在GEO数据库中，以“lung cancer+normal”为检索词和“series，Expression profiling by array，Home sapiens”为检索条件，搜索NSCLC 患者和正常人组织的基因芯片，共筛选了42 个样本（正常和NSCLC 基因样本各21个），并下载NSCLC 组织和正常组织的人源基因芯片的matrix 文件（文件编号为GSE118916）和记载探针和基因名字转化关系的平台文件（文件编号为GPL15207-17536），作为本文研究的样本信息。

1.4 差异基因（DEGS）的筛选与处理运用Perl（Practical Extraction and Report Language）软件，把样本信息中探针的名称转化成基因名称，得到一个新的基因文件；把42个样品基因分为正常基因（正常组）和癌症基因（实验组）两组，运用Perl 软件进行分析，得到样品表达的文件；利用R语言中的limma包，以“logFC（过滤阈值）filter=1，adjPflter（校正后的p 阈值）=0.05”为筛选条件，对样品基因进行差异分析，筛选出NSCLC组织较正常组织显著上调、下调的差异基因，利用Library（pheatmap）包绘制基因聚类热图和火山图。

1.5 中药化学成分及作用靶点数据库的建立利用TCMSP数据库，分别以血府逐瘀汤的组成药物（桃仁、红花、当归、生地黄、川芎、赤芍、牛膝、桔梗、柴胡、枳壳、甘草）为检索词，搜索血府逐瘀汤的药物靶点；再以“口服生物利用度（OB）≥30（其中甘草OB≥60）和类药性（DL）≥0.18为条件筛选其中药化学成分。运用Perl软件整理中药化学成分和药物靶点。

1.6 中药复方调控网络构建和分析将血府逐瘀汤各药物的靶点基因和NSCLC的差异基因取交集，以交集基因作为桥梁，得到药物有效成分和基因的关系与每个节点的属性；运用Cytoscapev3.6.0软件和JAVA8 软件，以上述交集基因和药物相关化学成分为输入数据，构建血府逐瘀汤化合物-靶点网络的可视化网络图。

1.7 ppi蛋白互作网络构建和网络拓补分析使用Cytoscapev3.6.0软件中的Bisogenet包，以基因为输入数据，利用深度数据包检测数据库（deep packet inspection，DPI）、蛋白相互作用数据库（biological general repository for interaction datasets，BIOGRID）、人类蛋白参考数据库（human protein reference database，HPRD）、BIND 等数据库，观察基因内部的相互作用关系，构建蛋白互作网络（protein-protein interaction networks，PPI）；利用CytoNCA 包进行网络拓补分析，找出临界节点数目相对较高的蛋白和蛋白之间相互作用比较紧密的蛋白，再用这部分蛋白去构建核心网络。

1.8 基因本体（gene ontology，GO）富集分析运用R 语言的“org.Hs.eg.db Bioconductor”包，以基因名称为输入数据，得到基因对应的id 文件；再利用R 语言的“colorspace、clusterProfiler、enrichlot”等程序包，以id 文件为输入数据，进行GO 富集分析，通过图像展示中药有效化合物的靶点蛋白在基因功能中的作用。

1.9 京都基因与基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析通过R语言的library（clusterProfiler、ggplot2）等包，以id 文件为输入数据，进行KEGG通路富集分析；运用Cytoscapev3.6.0 软件构建KEGG 关系网络，其结果以节点的形式形象地展示基因与信号通路之间的富集关系。

2 结果

2.1 差异基因表达通过对GEO 数据库中NSCLC患者与正常人组织的基因芯片进行数据挖掘，共获取NSCLC肺组织与正常肺组织的差异基因2861个，上调基因1313 个，下调基因1548 个。差异表达基因热图见图1，差异表达基因火山图见图2。

图1 差异表达基因热图

图2 差异表达基因火山图

2.2 化合物有效活性成分筛选利用TCMSP 数据库进行检索，以“口服生物利用度（OB）≥30（其中甘草OB≥60）和类药性（DL）≥0.18”为条件筛选血府逐瘀汤的中药化学成分，获得柴胡、赤芍、川芎、当归、红花、桔梗、牛膝、生地黄、桃仁、枳壳有效活性成分分别为17、29、7、2、22、7、20、6、23、5 个，血府逐瘀汤总有效活性成分为161个。

2.3 血府逐瘀汤的“化合物—靶点网络”可视化网络图运用Cytoscapev3.6.0 软件和JAVA8 软件构建血府逐瘀汤治疗NSCLC“化合物—靶点”的可视化网络图。先将1984 个血府逐瘀汤化合物靶点与2861 个NSCLC 靶点基因取交集，得到69 个交集基因，对应血府逐瘀汤中82 个候选化合物，包括柴胡有效化合物12个、川芎有效化合物4个、甘草有效化合物22个、桔梗有效化合物2个、牛膝有效化合物7 个，枳壳有效化合物4 个、红花有效化合物9个、桃仁有效化合物11个、赤芍有效化合物4个、多种药混合有效化合物7个。血府逐瘀汤候选化合物成分见表1。再把69个交集基因和82个血府逐瘀汤的候选化合物做为“化合物—靶点”的可视化网络图的节点，得到了397 条边，见图3。图中度值最高的化合物为槲皮素（quercetin），其次为毛地黄黄酮（luteolin）、汉黄芩素（wogonin）、甘草宁G（Gancaonin G）等。这些度值较高的化合物可能是血府逐瘀汤治疗NSCLC 的关键化合物。体现了血府逐瘀汤治疗NSCLC 的多靶点、多成分特点。

图3 血府逐瘀汤“化合物—靶点”的可视化网络图

表1 血府逐瘀汤候选化合物成分

2.4 血府逐瘀汤治疗NSCLC 的蛋白互作网络构建和网络拓补分析Cytoscape v3.6.0 软件的Bisogenet 包以69 个基因为输入数据，在DPI、BIOGRID、HPRD、BIND 等数据库中构建各共有靶点的蛋白互作网络。针对血府逐瘀汤治疗NSCLC，运用CytoNCA 包，以DC≥61，BC≥1500 为筛选条件，对临界节点数目较高的蛋白进行网络拓扑分析，绘制出由88 个关键节点组成的核心网络，核心网络关键节点名称见表2，筛选策略图见图4。

图4 筛选策略示意图

2.5 基因本体论（GO）富集分析GO 富集分析得到935 个GO 条目，列举生物学功能排名较靠前的20 个条目，见图5—6。图中显示血府逐瘀汤的中药活性成分主要富集在对活性氧的反应过程、营养代谢过程、类固醇激素代谢过程、对机械刺激的反应过程、氧化水平过程、镉离子响应过程等生物过程中；中药活性成分主要影响膜筏、膜微区、膜区域等细胞结构。

图5 GO富集功能分析（BP富集结果）

2.6 KEGG富集通路分析通过R语言的library（cluster Profiler、ggplot2）等包，对基因名字进行KEGG通路富集分析得到69条信号通路，列举排名靠前的20 个条目，见图7。主要包括膀胱癌信号通路、糖尿病并发症中的AGE-RAGE 信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、前列腺癌信号通路、乙型肝炎信号通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化信号通路、人类T细胞白血病病毒1型感染信号通路、细胞衰老信号通路、白介素17 信号通路、松弛素信号通路等，提示血府逐瘀汤通过作用于以上多条信号通路治疗NSCLC。

图6 GO富集功能分析（CC富集结果）

图7 KEGG富集通路气泡图

3 讨论

原发性肺癌是我国常见的恶性肿瘤之一，而NSCLC 是其最常见的类型，NSCLC 有很多致病因素。骆文斌等［7］认为肺癌的主要致病因素有邪毒留滞、饮食内伤、情志劳倦及体质等。邪毒侵肺，或情志内伤，导致肺失疏泄而生痰，或因饮食不节，平素过食生冷辛辣，致使脾胃运化功能失常，内生痰浊瘀血，蕴结于肺，形成积块。在众多发病机制中，痰瘀最为严重，二者相互影响，既是病理产物，又是致病因素，血府逐瘀汤方中黄芪益气固表；桃仁润燥行滞；红花止痛化瘀、引血下行；赤芍、川芎活血通经；生地黄清热活血、养血益阴；柴胡升达清阳、疏肝解郁；桔梗、枳壳宽胸行气，与柴胡同用，可使气血循环、理气行滞；甘草具有调和诸药之效。诸药合用可益气补肺、疏肝解郁、引血下行，达到化瘀、活血、行气的效果，对治疗NSCLC有良好疗效［8-9］，本研究运用中药复方网络药理学和基因芯片分析血府逐瘀汤的有效成分及作用靶点，为临床使用血府逐瘀汤提供数据支持。

从NSCLC 组织与正常组织的基因差异分析结果看，共获得两者的差异基因2861 个，上调基因1313个，下调基因1548 个，以此作为血府逐瘀汤治疗NSCLC 的靶基因。经过分析血府逐瘀汤的有效化学成分和药物作用靶点，构建中药复方治疗NSCLC 的调控网络图，发现槲皮素（quercetin）、毛地黄黄酮（luteolin）、汉黄芩素（wogonin）等化学成分的度值在图中排名靠前，槲皮素、毛地黄黄酮是血府逐瘀汤的混合药物有效成分，甘草、牛膝、红花等多种药物都含有这两种成分，汉黄芩素是牛膝的有效成分。目前药物有效成分的相关研究表明，槲皮素是一种天然类黄酮，它具有抗氧化，促进细胞凋亡，抗微小血管生成等作用，而氧化、细胞凋亡、免疫等是肿瘤细胞产生和恶变的基础，所以槲皮素贯穿肿瘤产生与发展的终始。槲皮素还能调控PI3K/Akt、MAPK、MMP-9 等的细胞信号通路，发挥抑制肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡、阻止肿瘤细胞侵袭及转移等作用［10-12］。毛地黄黄酮是一种天然植物多酚化合物，目前临床研究表明黄酮具有抑制氧化、抵抗炎症、抑制肿瘤细胞生长、抗动脉粥样硬化等广泛的生物学作用，其分子结构3，6 一二羟基黄酮具有较强的抗肿瘤活性分子，能够抑制肿瘤的发生、增殖、迁移、侵袭、血管生成以及耐药性等细胞生物过程［13］。汉黄芩素为中药牛膝的主要活性成分之一，是一种黄酮类化合物，黄恺飞等［14］研究发现汉黄芩素可以诱导人肺癌细胞A549 凋亡，其作用机制与下调Bcl-2、survivin表达、上调Bax蛋白有关。可见，血府逐瘀汤主要以槲皮素、毛地黄黄酮、汉黄芩素等化合物成分作用于NSCLC 基因，达到治疗（NSCLC 的目的。

从蛋白互作网络结果看，AKT1、PCNA、BRCA1、TP53等是血府逐瘀汤治疗NSCLC的关键靶点。AKT1能够参与细胞凋亡和葡萄糖代谢的细胞过程。在人基因里，TP53是非常重要的抑癌基因，在正常细胞中低表达，在恶性肿瘤细胞中高表达［15］；目前有很多关于RRM1 的报道，如王文然等［16-17］以54 例NSCLC 患者为研究对象，采用吉西他滨联合卡铂化疗方案，化疗前后检测肿瘤组织及外周血中BRCA1 与RRM1 的表达水平，结果发现肿瘤组织内RRM1 表达可作为预测非小细胞肺癌患者吉西他滨联合卡铂治疗预后的因子，可以推断出血府逐瘀汤主要作用于AKT1、PCNA、BRCA1、TP53 等靶点，达到治疗NSCLS的效果。

从GO富集分析和KEGG富集分析结果看，血府逐瘀汤的中药活性成分主要富集在对活性氧的反应过程、营养代谢过程、类固醇激素代谢过程、对机械刺激的反应过程、氧化水平过程、镉离子响应过程等生物过程中；其治疗NSCLC 的通路主要包括膀胱癌信号通路、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、前列腺癌信号通路、乙型肝炎信号通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化信号通路、人类T细胞白血病病毒1型感染信号通路、细胞衰老信号通路、白细胞介素17 信号通路、松弛素信号通路等。临床研究表明，血府逐瘀汤可以通过降低全血黏度、血小板黏附性，提高红细胞变形性及降低白细胞介素16等［18-20］炎症介质等多种途径，改善患者血流状况，起到治疗NSCLC 的作用、提高患者生存质量。但目前还缺少对血府逐瘀汤治疗NSCLC 的具体蛋白、具体信号通路的研究，本研究可以推断出血府逐瘀汤治疗NSCLC 直接或者间接涉及到的蛋白和信号通路，从而提高中医中药治疗NSCLC的成功率。

综上所述，本研究通过网络药理学和基因芯片分析方法初步探究了血府逐瘀汤多成分、多靶点、多通路的复杂机制过程，可为临床使用血府逐瘀汤治疗NSCLC提供数据支持。