姜曲海猪mtDNA D-loop 序列遗传多样性研究

韩大勇，赵旭庭，周春宝，陈章言，倪黎刚

（1. 江苏农牧科技职业学院，江苏 泰州 225300；2.江苏姜曲海种猪场，江苏 泰州 225300）

姜曲海猪是江苏省的一个历史悠久的优良地方猪种，主产于江苏省海安、泰州市姜堰区一带，中心产区位于泰州、南通、扬州三市，而以姜埝、曲塘、海安镇为主要集散地，因而得名。但姜曲海猪生长速度慢，瘦肉率低，自我国从国外引进瘦肉型猪品种并广泛推广后，姜曲海猪种群数量逐年减少，目前在江苏姜曲海种猪场存栏150 头左右种猪，数量较少，已进入国家地方品种资源保护名录。线粒体是动物细胞中重要的细胞器，线粒体DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）是动物体细胞核外遗传物质的重要载体，其分子量小，大小为16.5 kb 左右，呈共价闭合环状结构，具有进化速度快、遗传上自主性及严格的母系遗传等特性。研究表明线粒体DNA 的变异主要来源于突变，此特点对揭示动物群体的遗传转化关系比较准确，在家畜种群分类、群体遗传结构分析、经济性状的研究方面应用广泛。D-loop 为mtDNA的控制区，为非编码区，是mtDNA 分子内的高变区，进化过程中，D-loop 的碱基替换率是mtDNA 分子的其他区域的5～10 倍，通过对mtDNA 的D-loop 区域序列的变异情况进行检测，分析该区域的碱基转换、颠换、缺失、插入的情况，可以了解畜禽种内和近缘种间亲缘关系，同时分析种群的遗传多样性。

目前，有关姜曲海猪的线粒体DNA 的遗传特性规律研究少见报导。本研究以江苏姜曲海猪保种场保存的姜曲海猪核心种群猪只为主要对象，分析姜曲海猪保种群mtDNA D-loop 区多态位点的遗传变异情况，评价姜曲海猪群体种质资源特性及其遗传多样性，为姜曲海猪品种资源保护与开发利用提供理论参考。

1 材料和方法

1.1 样品采集

在江苏姜曲海种猪场采集58 头保种群姜曲海猪耳样，超低温冰箱冷冻保存备用。

1.2 DNA 提取扩增及测序

使用组织基因组DNA 抽提试剂盒（天根生化科技有限公司）提取的58 头姜曲海猪基因组DNA。在NCBI 数据库下载猪的线粒体序列（AJ002189），在待扩增区域两端选择保守区，利用Primer5 软件中设计如下引物：L99：5’-CCCAAAGCTGAAATTCTAA CTAAA-3’和H（451）：5’-GGTGAGATGGCCCTGAA GTAAG-3’，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

PCR 反 应 体 系：10 ×Buffer2.5 μL，dNTP （10 mmol·L）2 μL，上下游引物（ 10 μmol·L）各2 μL，Taq DNA 聚合酶0.21 μL，模板DNA100 ng，加双蒸水至25 μL。

PCR 条件：95 ℃预变性5 min，33 个循环（每个循环包括94 ℃变性1 min，59 ℃退火1 min，72 ℃延伸40 s），72 ℃继续延伸10 min，PCR 产物低温保存，送南京金斯瑞生物科技有限公司进行经回收、纯化、测序。

1.3 数据处理

使用DNASTAR 软件包中的Editseq 5.0 程序将PCR 扩增序列测序结果进行处理，然后利用Clustal（version:1.2.1）进行比对，并将比对结果进行手动校对，删除序列间隙和两端的不确定碱基。应用DNASP 5.10 分析线粒体DNA 序列单倍型多样性（h）和核苷酸多样性（π），用MEGA6 软件计算变异位点的确定及单倍型间的遗传距离（p-距离模式）。

2 结果与分析

2.1 姜曲海猪mtDNA D-loop 序列变异情况

用2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR 扩增产物，发现1 条450 bp 左右的特异性条带，PCR 产物经回收纯化后测序，获得了58 个样本的扩增序列，去除引物序列及两端测序可能不准确区域，获得的有效序列基因片段长度为427 bp （AJ002189 的第15 425～15 851 bp）。在姜曲海猪的mtDNA D-loop 高变区扩增测序的有效序列基因片段中，碱基A+T 含量为63.2%，G+C 含量为36.8%，A+T 含量明显高于G+C含量，与以前的研究报道线粒体控制区富含AT 的结论相一致。利用Clustal 软件进行同源序列比对，结果发现在该检测区段，58 个姜曲海猪在该区段得到3 种单倍型，3 个单倍型个体数相差不大，3 个单倍体中有15 个多态位点（表1），表明姜曲海猪保种群单倍型数量少，种群的遗传多样性不高；多态位点中有13 个单一性可变位点、2 个简约性变异位点，多态性位点比例为3.51%；序列中转换频率较高，颠换发生的较少，序列中无碱基缺失和插入；其中有10 次T／C 转换，3 次G／A 转换、1 次A／T 颠换、1 次C／A 颠换，转换和颠换之比为6.5∶1，显示出强烈的转换偏倚现象，这是动物mtDNA 的一个显著特征。

表1 姜曲海猪mtDNAD-loop 区多态位点

2.2 种群遗传多样性

应用DNASP 5.10 软件对测序结果进行核苷酸多态性分析，结果表明姜曲海猪58 个样本单倍型数量为3，单倍型多样度为0.686±0.018，核苷酸多样度（π）为0.005 2±0.000 85。单倍型多样性指数及核苷酸多样性分析结果说明姜曲海猪种群遗传多样性较低。对姜曲海猪mtDNA D-loop 区序列进行中性检验，Tajima’s D 值为-0.927 55，差异不显著（P＞0.05），符合中性突变。

2.3 种内遗传距离

对样本进行基于kimura 双参数的遗传距离计算，由表2 看出，58 个个体的3 个单倍型之间的平均遗传距离为0.003～0.005，其中单倍型H3 与其他2个单倍型之间的距离较大，而单倍型H1、H2 之间的距离比较小，总体分析，3 个单倍型之间的距离不大。

表2 姜曲海猪mtDNA D-loop 单倍型间遗传距离

3 结论与讨论

3.1 姜曲海猪线粒体DNA 控制区的序列变异

在58 个姜曲海猪个体的mtDNA D-loop 高变区427 bp 的比对序列中，共得到15 个变异位点和3种单倍型，多态性位点比例为3.51%。亐开兴等研究表明云南保山猪19 个个体的mtDNA D-loop 高变区中发现8 个多态位点，多态位点比例为1.83%；而刘益平等研究表明苏钟猪21 个个体中发现多态位点16 个，多态位点比例3.62%；彭红元等研究表明陆川猪在74 个个体中检测到7 个单倍体，共发现20 个变异位点。本研究中发现姜曲海猪的线粒体单倍型和多态位点相对较少，虽然3 个单倍体的个体数量基本均衡，但还是能反映出姜曲海保种群母系来源较少，群体多样性较低的特征。DNA 序列中有转换和颠换2 种形式的碱基替换，多数的研究结果认为，线粒体基因组DNA 发生转换的频率要远高于颠换。本研究中，姜曲海猪线粒体DNA 序列发生13 次碱基转换，2 次碱基颠换，转换次数显著高于颠换，这与其他物种有一致的结果。

3.2 姜曲海猪的遗传多样性

衡量一个品种（群体）mt DNA 变异程度的两个重要指标是单倍型多样度（Hd）和核苷酸多样度（Pi），单倍型多样度是指样本中随机抽取到2 个不同单倍型的频率、核苷酸多样度是指给定群体内随机选取的mtDNA 序列间的平均每个位点的核苷酸差异数目。Hd 和Pi 值越大，群体的多态程度越高，其遗传多样性越丰富。本研究中，姜曲海猪的核苷酸多样性指数和单倍型多样性指数分别为0.005 2 和0.686，核苷酸多样性指数较低，单倍型多样性指数较高，分析其原因可能是受种群的数量对该猪遗传多样性的影响，虽然通过碱基突变积累了比较好的单倍型多态性，但对核苷酸序列的多样化积累效果较少。因此姜曲海猪今后的保种工作的重点应放在提高姜曲海群体核苷酸多样性方面。

3.3 姜曲海猪群体内3 个单倍型之间遗传距离

利用线粒体D-loop 区进行的分子遗传距离分析是基于母系起源方面的，有别于其他技术方法计算出的遗传距离。彭红元等研究陆川猪种群内遗传距离在0.003～0.005 之间，各种群间的遗传差异很小；丁玫等研究白洗猪各单倍型之间遗传距离变化范围在0.003～0.007，各个单倍型之间的距离总也不大。本研究从线粒体层面计算的姜曲海猪各单倍型之间的遗传距离在0.003～0.005 之间，各单倍型之间的遗传距离较小。分析产生这种结果的原因主要是姜曲海猪种群长期独立在保种场内进行人工选择和群内繁殖，几乎没有与场外的交流，造成各单倍型之间的遗传距离交小，遗传多样度不高。因此必须对姜曲海猪的保种方案进行优化和完善，提高保种群遗传多样性。

3.4 姜曲海猪的种质资源保护

姜曲海长期保存在一个相对闭锁的保种场，近交繁殖。但受保种经费、技术等因素的影响，姜曲海种群数量较小，小群体繁殖所导致基因丢失和遗传漂变，进而造成姜曲海猪保种种群的遗传多样性较贫乏，种群的延续能力降低。因此姜曲海猪保种过程中，要加强姜曲海遗传多样性的研究，通过其他技术方法进行主要性状的遗传标记研究，建立种群的遗传谱系，较准确的进行个体识别，在选种选配过程中，让不同单倍体群间进行配种，促进种群间基因交流，提高种群遗传多样性。