金花茶组培玻璃化苗的预防及控制技术研究

韦金梅，朱其伍，俞建妹，钟 柳，唐相红

(广西壮族自治区南宁树木园，广西 南宁 530031)

金花茶（Camellia chrysantha（Hu）Tuyama)是山茶科山茶属植物，国家一级保护植物[1]。金花茶1933年首次在广西防城被发现，国内将金花茶誉为“茶族皇后”，国外则称之为“幻想中的黄色山茶”，其具有较高的观赏价值、药用价值和科研价值[2]。金花茶目前主要以种子或扦插繁殖，所需母株较多且苗木生长速度相对较慢，苗期参差不齐，难以短时间繁殖较多的优质种苗，组织培养能够在短时间内培育出大量的优质种苗，可较好地解决此问题。南宁树木园自2014年7月起开展了金花茶组培技术应用研究工作，目前已实现了产业化生产。但在生产实践中易形成玻璃化苗（图1）。玻璃化苗是植物组织培养中普遍发生的一种生理失调或生理病变，其不易分化和生根，移栽成活率很低，且很难恢复正常，严重影响组培快繁体系的稳定性[3]。组培苗玻璃化与接种外植体、培养基及培养条件关系均十分密切[4—5]。培养基直接为组培苗提供支撑介质，与组培苗玻璃化关系尤其密切[6]。为了预防及控制玻璃化苗，本试验通过在培养基中添加CH、琼脂粉及蔗糖，并调整不同光照强度，研究不同添加物浓度和光照强度对芽苗玻璃化的影响，旨在为金花茶组培育苗提供参考。

图1 玻璃化苗

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为广西南宁树木园金花茶基因库中生长健壮、花朵繁多、花瓣蜡质纯黄、32年生的金花茶优良单株种胚。

1.2 试验方法

1.2.1 无菌材料的获得采集六七成熟的金花茶种子，洗净去果皮后放入超净工作台待用。种子在1%的升汞溶液浸泡种子6～8 min后，用无菌水冲洗8～10遍，再用无菌滤纸吸干表面的水分，去掉种皮，将种胚接种于培养基中暗培养7～10 d,待胚根及胚芽伸长生长后进行光照培养。胚芽伸长生长达3 cm以上且半木质化后进行芽苗扩繁。

1.2.2 芽苗扩繁将剪下的芽苗单株接种于改良MS继代培养基（MS+Na2SO450.0 mg/L+6-BA3.0 mg/L+NAA1.0 mg/L）中进行培养。芽苗基部分化出丛生芽，达到扩繁要求。在丛生芽伸长生长培养过程中，部分芽苗易发生玻璃化，不利于形成有效芽。通过在培养基中添加有机物及改善光照条件，可较好地防治玻璃化，利于有效芽苗的扩繁。

1.2.3 不同添加物对芽苗玻璃化的影响通过对培养基添加不同质量浓度的CH、琼脂粉及蔗糖，研究对芽苗玻璃化的影响，本试验采用L9（34）进行试验设计。CH质量浓度分别为200 mg/L、300 mg/L、400 mg/L，琼脂粉质量浓度分别为4 g/L、5 g/L、6 g/L，蔗糖质量浓度分别为20 g/L、30 g/L、40 g/L。试验共9个处理，每个处理接种20瓶，每瓶接芽3丛，3次重复，培养40 d统计新芽玻璃化情况。

1.2.4 不同光照对芽苗玻璃化的影响将丛芽接种于不同的改良MS培养基后，置于不同光照强度下培养，光照强度分别为800～1 000 lx、1 000～2 000 lx、2 000～3 000 lx、3 000～4 000 lx，试验共4个处理，每个处理接种50瓶，每瓶接芽3丛，光照时间12～14 h/d，培养40 d统计新芽芽高及玻璃化情况。

1.3 培养条件

培养基pH=6.0，在1.1 MPa、120℃高温高压条件下灭菌消毒20 min。培养室温度（23±2）℃，接种初期暗培5～7 d，然后以设计的光照强度和时间进行培育。

1.4 数据分析方法

试验数据采用Excel 2013及SPSS 18.0进行统计及分析。

2 结果与分析

2.1 不同添加物对芽苗玻璃化的影响

从表1、2可知，不同添加物对芽苗的生长均存在一定的影响，组间存在显著性差异。处理1—处理3中，芽苗高度为3.0～3.5 cm，处理4—处理9中，芽苗高度为5.8～6.5 cm。处理1—处理6中，芽苗的玻璃化率低于20%，在处理7—处理9中，芽苗玻璃化率高达79%以上，对生产影响较大。需对各添加物不同浓度进行显著性分析。

表1 正交试验设计L 9（34）芽苗苗高及玻璃化率统计表

表2 芽苗玻璃化方差分析

2.2 CH质量浓度对芽苗玻璃化的影响

从表3及丛芽扩繁情况可知，各芽苗扩繁系数一致，但长势参差不齐，由此可知，CH对扩繁系数不存在较为明显的影响，但对芽苗的生长影响较大。当CH质量浓度≤300 mg/L时，芽苗玻璃化率≤14.63%；当CH质量浓度达到400 mg/L时，芽苗玻璃化率高达84.44%，由此可知，芽苗生长中需要CH促进细胞分裂的速度，但其对细胞内部成分又存在一定的改变作用，即可促进芽苗生长，同时因量大会起到一定的毒害作用，这与洪森荣等[7]研究水解乳蛋白和水解酪蛋白对黄独试管苗生长发育的影响的结论一致。因此，本试验培养基中CH质量浓度为300 mg/L时较佳。

表3 CH对芽苗玻璃化显著性分析

2.3 琼脂粉对丛芽玻璃化的影响试验

从表4可知，本试验中的琼脂粉质量浓度对芽苗的玻璃化影响存在显著差异（P<0.05），最佳用量6 g/L。从玻璃化率的数值可知琼脂粉的质量浓度对玻璃化有明显的影响，这与琼脂粉的物质特性有关。琼脂粉主要材料为藻类，主要用以凝固营养液，用量以材料能便于插入及立稳于营养液中为度，同时可提供一定的养分及控制瓶内湿度。湿度是造成玻璃化苗的主要原因之一，琼脂粉质量浓度高时,可降低培养基含水量及瓶内湿度,从而降低组培中的玻璃化苗发生的概率，这与尹品训等[8]在2004年研究大麻组织培养中玻璃化苗的结论一致。

表4 琼脂粉对芽苗玻璃化显著性分析

2.4 蔗糖对丛芽玻璃化的影响试验

从表5中可知，随着蔗糖质量浓度的变化，芽苗的玻璃化率存在较大的变化，当蔗糖质量浓度达到40 g/L时，玻璃化率低至13.33%，与质量浓度为20 g/L和30 g/L的处理间存在显著差异（P<0.05）。可能原因是芽苗生长需要较多的碳源，当蔗糖质量浓度达到40 g/L以上时可满足其碳需求，促进芽苗健壮，有效降低玻璃化率。因此，本试验培养基中蔗糖质量浓度达到40 g/L时，可较好地降低瓶苗玻璃化。

表5 蔗糖对芽苗玻璃化显著性分析

2.5 光照对丛芽玻璃化的影响试验

金花茶喜阴喜湿不耐旱、怕晒不耐高温，但在生长过程中却又需适宜的光照。从表6可知，当芽苗长时间处于光照强度<1 000 lx的环境中，其玻璃化率高达45.33%，不利于芽苗的生长及用于扩繁或生根；当芽苗长时间处于光照强度1 000～2 000 lx的环境中，其玻璃化率为8.00%，但不利于生长；当芽苗长时间处于光照强度>2 000 lx的环境中，其玻璃化率为0，但不能长时间处于强光照的环境中，如长时间处于>3 000 lx的环境中会使长势变差，枯死现象严重，难存活，最好的光照环境为2 000～3 000 lx，芽苗生长健壮。可能原因为在一定的光照强度时间内，随着光照强度的增加，会促进细胞叶绿体的形成，促进光合作用的进行，合成更多的有机物，有利于细胞壁、细胞器形态的建成，从而减少玻璃化的发生[9]。

表6 光照强度对芽苗玻璃化的影响

3 结论与讨论

3.1 结论

金花茶芽苗在添加CH 300 mg/L、琼脂粉6 g/L、蔗糖40 g/L的改良MS培养基中，在光照强度为2 000～3 000 lx的环境下培养，苗平均高度可达6.0 cm以上,平均玻璃化率可降至为0，生长健壮，可进行单芽生根（图2、图3）。

图2 不定芽壮苗

图3 不定芽生根

3.2 讨论

在生产过程中，为了降低生产成本及加快苗木在室内培育的周转速度，以预防发生玻璃化苗为主，一旦发生玻璃化苗现象，基本上采取培养基处理及加强光照强度时间并及时去除已产生的玻璃化苗，在材料充足的情况下不会采取对玻璃化苗处理后使其逆转直至恢复成正常苗，主要原因为逆转时间过长且恢复后的芽苗难以生根，不适合生产上短周期以减少成本的应用。如何将玻璃化苗进行短期内逆转后可成为用于生根的有效芽苗有待进一步研究。