猪轮状病毒病诊断与防控研究进展

李元新，陈伯祥，赵子惠，成伟伟，杨 明 ，蒙 琦

(甘肃省畜牧兽医研究所，甘肃 平凉 744000)

猪轮状病毒病是由猪轮状病毒(Porcine rotavirus，PoRV)引起的仔猪一种以急性腹泻为特征的急性肠道传染病。主要特征表现为厌食、呕吐、腹泻、水样和糊状粪便等症状，病程后期严重脱水导致仔猪死亡。在室温环境中，病毒的感染力可保持7～9个月。猪轮状病毒病潜伏期为16～24 h，该病不仅在我国大范围流行，而且发病率和死亡率极高，给养猪业造成巨大的经济损失。由于临床症状和流行病学表现与猪传染性胃肠炎(TGE)、猪流行性腹泻 (PED) 非常相似，在实际生产中往往难以诊断而错失最佳治疗时机，从而导致仔猪大面积死亡。因此，掌握猪轮状病毒病检测技术对该病的诊断和防治均具有重要意义。本文就猪轮状病毒病的临床和实验室诊断技术及其优缺点进行全面综述，旨在为本病的监测和综合防控提供技术支持。

1 临床及病理诊断

1.1 临床诊断

对于养殖基础薄弱，经济条件差的养殖户来说，临床诊断是他们常用的一种诊断方法，该方法主要根据养殖经验对仔猪出现的嗜睡、呕吐、腹泻、食欲减退，并伴有腹泻，初期粪便水样、糊状、半固体状或似乳清样，之后逐渐变为一种黄绿色和灰白色等临床症状来判断。虽然在一定程度上可以诊断并治疗该病，但由于病原未知，存在巨大的潜在风险。

1.2 病理剖检诊断

猪轮状病毒病在解剖后可以明显地看到消化道炎症，由于感染猪轮状病毒后，仔猪胃肠功能减弱，表现胃部存有大量乳凝块，小肠部的粪便颜色变暗发黑，肠部淋巴结肿胀严重。通过镜检观察，发现小肠绒毛萎缩变短，空肠和回肠表现为微绒毛变少，上皮细胞从柱状变成扁平状。

2 实验室诊断

2.1 病毒的分离鉴定

目前诊断猪轮状病毒病经典技术方法是病毒分离鉴定。将病料处理后接种于适宜细胞，传代并根据细胞病变状况来判定PoRV阴阳性，该法虽然直观，但存在试验时间长、操作步骤多，价格偏高等不足。国内学者已成功分离出了猪A群轮状病毒毒株。库旭钢等(2012)从腹泻仔猪采集粪便样本经处理接种在MA-104细胞上，通过分离鉴定最终判定为猪轮状病毒。张贺伟等(2014)将腹泻仔猪的粪便处理后接种于筛选的该毒株的最适细胞系MA-104上，经过分子生物学鉴定和遗传学分析，成功分离出了猪A群轮状病毒毒株。但该法过程繁琐，耗资较大，目前基层已应用较少。

2.2 电镜观察诊断

应用电镜观察时发现，轮状病毒粒子的形状看起来像车轮，对采取的病料用磷钨酸来感染处理，在电镜下找到特征性的病毒粒子，测定直径，再拍照保存。最后根据所得病毒颗粒的直径大小是否符合病毒颗粒直径范围来判断检测结果的阴阳性。直接电镜法主要主要用来检测动物粪便，免疫电镜法主要用于动物血清检查，虽然该方法操作简单、直观高效，较病毒的分离鉴定在人员操作上要求不高。但所使用的电镜设备价格昂贵，不适宜在基层进行大规模推广。

2.3 血清学诊断

2.3.1 免疫荧光检测(IFA) 利用IFA检测猪轮状病毒是将患病猪粪便或病死猪肠道内容物经处理后制成涂片，经固定、染色，用荧光显微镜观察，这种方法在诊断轮状病毒中应用最普遍，但对操作人员的实验技术和样品质量的要求均比较严格。

2.3.2 酶联免疫吸附试(ELISA) ELISA方法作为经典的病毒检测方法，因其操作方法简单，能对大批量样品进行检测，污染小且检出率高等特点，近几年在基层和各实验室已普遍应用，特别是对基层兽医部门进行大量样品检测和流行病学调查带来了方便。近年来，为达到方便使用，提高检出效率，以便更好地适应于基层，许多科研工作者在方法上做了大量的创新研究。孟柳等建立了的间接ELISA，利用纯化的猪轮状病毒的VP6蛋白成功检测到了猪轮状病毒血清抗体。同样，陈淑华等以猪群轮状病毒VP6基因表达的蛋白作为抗原，建立起的间接ELISA方法能够快速检测出其IgG抗体，总符合率可达91.5%以上，在猪轮状病毒病流行病学调查上应用较广，在猪群抗体水平的监测上也有所应用。黄小波等利用双抗体夹心ELISA方法成功检测到了猪轮状病毒。各种ELISA方法因其高效、简单而被广泛应用于基层兽医部门的样品的检测，但由于该方法重复性不够强，因而具有一定的局限性。Zhu JY Yang等利用在大肠杆菌中表达的PoRV VP6基因在兔体内产生抗体，建立一种能区分PoRV和其他猪病毒的鉴别ELISA方法， 抗VP6血清抗体可作为PoRV检测的良好诊断试剂。Nagesha H S 等通过酶免疫分析利用VP7特异性单克隆抗体直接对猪轮状病毒进行血清分型，采用单克隆抗体进行血清型环评试验，将细胞培养适应的猪轮状病毒和粪便轮状病毒分为血清型G3、G3/5、G4和G5。该单克隆抗体证实并扩展了多克隆抗血清的血清分型结果。因此，这些单抗是猪轮状病毒血清分型的潜在试剂。使用亚群特异性单克隆抗体，发现G3、G3/5和G5血清型含有亚群I抗原，而G4轮状病毒含有亚群II或亚群I抗原。

2.3.3 胶体金免疫层析技术(GICA) GICA是一种高效的免疫学测定方法，结合了胶体金标记技术和免疫层析技术的优点重新组合而建立起来。其基本原理是通过微孔膜渗透作用和毛细现象，使抗原抗体在固相膜上结合并迅速反应，然后利用胶体金标记抗体直接显色来判断阴阳性。为使该项技术在轮状病毒检测应用中发挥作用，也有研究者研制出了检测猪轮状病毒的胶体金试纸条。该方法整个过程仅需15 min左右，但也存在一些不足，如样品质量难以控制、灵敏性差、难以定量等。

2.4 分子生物学诊断方法

2.4.1 RT-PCR 诊断 RT-PCR是一种实验室常用的分了生物学诊断技术，它可以利用少量的核酸样品能准确地检测到RNA序列。张双翔等根据猪轮状病毒VP6和VP7不同的基因序列，成功设计出了2对RT-PCR特异性引物，建立起针对不同靶基因的猪轮状病毒快速检测方法，均有明显的特异性。张维谊等建立的猪轮状病毒RT-PCR检测方法在PoRV、TGEV)、PEDV的病毒检测试验中发现，后两者均表现为阴性，体现出了很强的特异性。该方法与传统的血清学和免疫学方法相比，能够快速检测到组织中是否有病毒感染。但由于该方法需要特定的仪器设备和试剂，在基层难以推广应用。

2.4.2 多重RT-PCR技术 多重RT-PCR技术是病毒鉴别诊断的重要技术手段，它可以将设计好的多对引物在一次反应中同时扩增，避免了逐一分离病毒的复杂程序。任玉鹏等建立起的能同时进行检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪群轮状病毒(GAR)的多重 RT-PCR鉴别检测方法，均能很好的检测出该三种病毒的阳性结果，同时猪萨佩罗病毒(PSV)、猪博卡病毒(PBoV)、猪环曲病毒(PToV)、金黄色葡萄球菌(SA)猪链球菌2型(SS2)、猪源大肠杆菌(E. coli)、猪源沙门氏菌(S.choleraesuis)、空肠弯曲杆菌(Cje)检测结果均为阴性，证明该法具有较强的灵敏性和特异性。王睿敏等对猪流行性腹泻病毒 (PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒 (TGEV) 、猪Delta冠状病毒(PDCoV)和猪轮状病毒 (PRoV)建立了多重 RT-PCR检测方法，并且用该方法对2017年至2018年从广西各地采集的270份腹泻样本进行了检测，结果都验证了该方法可行有效，对猪病毒性疾病的流行病学调查意义重大，应用前景广阔。

刘海源等针对建立PEDV、TGEV和RV的保守基因M、N和VP7分别设计了特异性引物，建立了PEDV-TGEV-RV的多重PCR方法，PEDV、TGEV和RV的保守基因M、N和VP7分别设计了特异性引物，分别扩增出预期的311 bp、763 bp和516 bp的目的片段，成功建立同时检测猪三种常见病毒感染的多重PCR方法。通过敏感性和特异性的试验，发现本方法对PEDV、TGEV、RV的最高敏感度分别为30 pg，TGEV的最高敏感度为18 pg，RV的最高敏感度为42 pg，并通过对其他常见几种病原进行PCR扩增，发现本方法特异性良好，可以应用于临床样品检测。利用该检测方法对2015年到2016年来自山东省济南、泰安、莱芜等发病猪场的并对412份临床病料进行检测，结果表明PEDV、TGEV和RV的阳性率分别为22.3%、7.28%和1.46%，PEDV与TGEV、PEDV与RV、TGEV与RV双重混合感染阳性率分别为5.34%、1.94%和2.91%，PEDV、TEGV和RV三重感染阳性率为4.85%。Kerlei C. Médici等采用RT-PCR方法检测A组轮状病毒，采用一致引物扩增VP4基因的876 bp (P型)和VP7基因的1062 bp (G型)， 利用轮状病毒B12组8号基因(NSP2)的434 bp扩增产物和轮状病毒C组5号基因(VP6)的270 bp扩增产物的半巢式PCR方法鉴定了非典型轮状病毒。

2.4.3 实时荧光定量RT-PCR 技术 实时荧光定量PCR技术(Real-Time Quantitative PCR)。它是将RT-PCR技术与光谱技术相结合的一种核酸定量检测技术。具有敏感性高、特异性强、重复性好、全封闭反应、定量准确等特点。与常规RT-PCR相比，实时荧光定量RT-PCR克服了假阳性和污染环境问题。陈小飞等根据GenBank中近些年来猪轮状病毒A群 VP6的序列分析，选取保守区域设计引物，成功构建立了TB Green荧光定量PCR 检测方法。对阳性标准质粒的检测下限为106拷贝/μL，敏感性是普通RT-PCR的3.54倍，在这个方法的应用过程中采集了91份临床病料来检测，结果发现40份病料呈阳性。对猪呼肠孤病毒(MRV)、猪瘟病毒(HC)、巴氏杆菌(PM)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRS)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪捷申病毒(PTV)、链球菌(SS)以及猪等孢球虫(I.suis)检测均为阴性。陈如敬等根据猪轮状病毒的 VP6 基因特征设计具有特异性的引物和探针，经过优化反应条件，建立了一种检测猪轮状病毒的 TaqMan 实时荧光定量RT-PCR 方法，最低可检测 192拷贝/μL。对该方法的应用中采集了79份病料，检测结果发现了6份样品是阳性，说明了该方法特异性强，灵敏性高。但由于该方法对操作人员专业技术水平的要求较高，并需要一定的仪器设备，在一般实验室难以普及应用。Elizabeth C.M. Marconi等〗以RV的NSP5基因的一段保守序列为靶向基因建立了SYBR-Green实时聚合酶链式反应(PCR)。 A组轮状病毒(RVA)是人类和几种动物腹泻的最常见原因之一。运用该方法与采用SYBR-Green实时聚合酶链反应(Real-Time polymerase chain reaction, PCR)，以牛nadh - desrogenase - 5 mRNA为外源内参，靶向扩增非结构蛋白5 (non - structural protein 5, NSP5)基因的137 bp片段，对常规PCR对 65份猪粪便标本中的RVA进行诊断。 65份样本进行了检测(25份常规PCR和基因测序检测呈阳性)。 总体一致性(kappa)为0.843，表明各项试验的一致性“非常好”，相对灵敏度为100% (25+Real Time PCR/25+ Conventional PCR)，相对灵敏度为87.5% (35- Real Time PCR/40- Conventional PCR)。分析结果表明，该方法具有较高的重复性(变异系数≤1.42%)。因此，该方法是一种快速、灵敏的猪RVA诊断方法。

2.4.4 逆转录环介导等温扩增技术(RT-LAMP) RT-LAMP近些年来被广泛应用于动物疫病病原基因检测，它也是一种快速等温核酸扩增技术，与RT-PCR法相比，RT-LAMP法省去了RT-PCR法中的预变性、变性、退火步骤即可循环扩增，反应产物判定不需要电泳，肉眼就能够判定。该方法极大地缩短了检测时间，结果可自动判读，临床实用性高，应用前景更加广阔。据文献报告，其最低可检出10基因拷贝。胡兴义等就已经利用此方法建立起了猪轮状病毒逆转录环介导等温核酸扩增(RT-LAMP)技术，结果对203份猪腹泻样本检测，检出阳性样本16份，灵敏度能达到1.0×102拷贝/μL。该方法在恒温条件下进行，无需特殊仪器，适合应用于基层养殖场。

3 PoRV 防控

目前防控 PoRV的疫苗主要有减毒活疫苗、灭活疫苗、亚单位疫苗、基因工程疫苗等。中国农业科学院哈尔滨兽医研究所冯力等人研制成功TGE-PED-RV三联活疫苗，防治猪病毒性腹泻病方面发挥了重要作用。史月明等研制成功的油乳剂灭活疫苗 , 免疫仔猪可以刺激机体产生免疫应答和保护性抗体。Oneal 等 将 RV 的核酸亚单位片段VP2/6- VLPs、VP2/4/6-VLPs 与霍乱毒素混合研制出亚单位疫苗，免疫动物后可使受试动物得到良好保护。目前国内学者利用杆状病毒表达系统表达了多种形式的 VLPs(6/7-VLPs、2/6/7-VLPs、2/4/6/7- VLPs)，发现这些 VLPs 都具有较好的免疫保护效果。使我国猪病毒性腹泻病得到精准防控，极大的减少了经济损失。针对 PoRV 目前还没有特异性治疗药物，主要采取疫苗预防，药物治疗，做好消毒，注意保暖，营养均衡等措施达到防控的目标。

4 结语

对于猪轮状病毒病，仅仅依据临床症状和剖检变化来作出判断是具有一定局限性的，只有结合实验室诊断才能最终确诊该病的发生，但各种实验方法又不能完全满足检测的实际需要。例如，电镜观察诊断操作简便，直观高效，但由于实验仪器电镜价格昂贵，无法在基层单位推广使用；免疫学方法能够检测猪轮状病毒感染、发生、发展的过程，但由于抗体只在感染至特定时期才出现，所以ELISA等抗体检测方法具有一定局限性；实时荧光定量PCR、RT-LAMP、RT-PCR、多重RT-PCR等分子生物学技术在猪感染猪轮状病毒早期就可以检测到病毒核酸，对于猪轮状病毒早期检测具有重要作用，但对操作技术要求相对较高。国内外关于猪轮状病毒病的研究虽然起步较晚，却引起了学者的广泛关注，并取得了许多猪轮状病毒病诊断技术方面的成果。由于各种诊断方法均有优缺点，因此要根据诊断的目的和要求，并结合实际条件选择合适的诊断方法。目前市场上已有多家公司根据不同的诊断技术提供了多种猪轮状病毒病的检测试剂盒，为该病的快速诊断提供了有力保障。为了实现诊断方法的便捷性和诊断试剂的商品化，应将各种诊断方法有机地结合起来，取长补短，从而达到最佳的检测效果，实现对猪轮状病毒感染及时、快速检测。相信将来随着分子生物学方法和免疫学技术的不断发展，猪轮状病毒病的诊断技术会愈加高效、便捷。同时，对猪轮状病毒病采取综合防控措施，能大大减轻该病的发生，促进养猪业健康发展。