离子液体液-液微萃取鸡肉四环素HPLC 法的检测

林志銮，张传海，马春华，张静，詹宝珍

（1.武夷学院 福建省生态产业绿色技术重点实验室，福建 武夷山 354300；2.武夷学院 茶与食品学院，福建 武夷山 354300；3.福建农林大学 食品科学学院，福建 福州 350002）

土霉素(OTC)、四环素(TC)、金霉素(CTC)、多西环素(DCC)属四环素类(TCs)抗生素，由于价格便宜和广谱抗菌性被广泛用于养殖业[1]。为此，GB 3838—2002《地表水环境质量标准》[2]和GB 2763—2014《食品安全国家标准食品中农药残留最大限量》[3]中对四环素的含量都有严格的规定。为此建立一种快速、准确的分离、提取和检测四环素方法显得十分重要。

实验室中对四环素的主要提取方法有:固相微萃取发[4]、超声萃取[5-6]、微波辅助萃取[7]、离子液体富集[8]等方法。离子液体（ionic liquid）具有萃取和分离弱极性、非极性、极性物质的能力，广泛应用于天然产物提取[9]。对均相萃取、异相分离的特点，可实现连续操作、易于放大等优点，广泛应用与对抗生素、农残、兽残的富集、提取[10-11]。

论文建立离子液体液-液微萃取超声波辅助提取法从鸡肉中提取4 种四环素类抗生素，并用高效液相色谱法(high-performance liquid chromatography,HPLC)测定。探讨离子液体种类、用量，分散剂种类、用量，超声波时间对鸡肉中的四环素萃取的影响，通过HPLC法测定鸡肉中四环素的含量，以期为鸡肉中痕量/超痕量四环素类抗生素的分离富集提供一种新方法。

1 检测实验

1.1 材料与试剂

鸡肉:散装鸡肉购于武夷山某超市。

1.2 标准品与试剂

四环素(TC)，土霉素(OTC)，北京百灵威科技公司，纯度98%；多西环素(DCC)，金霉素(CTC)，美国Aladdin 公司，纯度90%；甲酸，乙腈，国药集团，色谱纯；甲醇,乙醇,丙酮，国药集团，1-丁基吡啶四氟硼酸盐（[Bupy][BF4]）、溴化1-辛基-3-甲基咪唑（[OMIM]Br）、1-丁基-3 甲基咪唑六氟磷酸盐([OMIn][PF6])，美国Aladdin 公司，分析纯。实验用水为纯净水。

1.3 主要仪器设备

1260 高效液相色谱系统；C18色谱柱（TC，4.6 mm×150 mm，5 μm），美国安捷伦科技有限公司；TGL-21M，高速冷冻离心机，湖南湘仪实验室仪器开发责任公司；DHG-9071A，电热恒温鼓风干燥箱，上海精宏实验设备有限公司；ME55/05，分析天平，上海梅特勒-托利多仪器公司；S6H，超声波清洗机，厦门致微仪器公司。

1.4 溶液的配制

标准液的配置: 准确称取DCC、CTC、TC、OTC 标准品各0.01 g，溶解后转移到10.00 mL 的容量瓶中定容，即为10.00 mg/mL。实验中所需的标准溶液均由该标准母液适当稀释后配制。

1.5 实验方法

1.5.1 色谱条件

流动相:A 为0.20%甲酸水溶液，B 为水。洗脱程序流速:1.00 mL/min；柱温:26 ℃；检测波长:350 nm，进样体积:10 μL。

表1 洗脱程序Table 1 Elution procedure

1.5.2 工作曲线测定

准确配制DCC、CTC、TC、OTC 混合母液的浓度:0.50～50 μg/mL，按照1.5.1 色谱条件进行进样。以DCC、CTC、TC、OTC 峰面积为纵坐标，DCC、CTC、TC、OTC 浓度为横坐标建立方程，并获得相关系数R。

1.5.3 样品前处理

鸡肉经过搅碎均质处理后，准确称取10.00 g 鸡肉样品，加入20.00 mL 0.20%甲酸水溶液，在功率为100 W条件下超声辅助提取30 min 后，粗提液减压抽滤，转移到50 mL 容量瓶中定容。准确移取9.00 mL 粗提液于离心管中，加入450 μL 3.00%的离子液体与720 μL丙酮，使用超声辅助提取，提取时间15 min，功率100 W。以4 000 r/min，4 ℃放入冷冻离心机中离心8 min。取底部溶液1.00 mL，过0.45 μm 滤膜，待测。

1.5.4 萃取剂的选择

按照1.5.2 实验步骤，讨论加入不同的离子液体（[OMIn][PF6]、[OMIM]Br、[Bupy][BF4]）及不同的分散剂（甲醇、丙酮、乙腈、乙醇）进行微萃取对4 种四环素萃取的影响。

1.5.5 单因素实验

按照1.5.2 实验步骤，讨论加入不同的离子液体体积分数（1%、2%、3%、4%、5%），不同的分散剂用量（480、600、720、840、960 μL）、不同的微萃取时间（5、10、15、20、25 min）、不同的超声功率（50、75、100、125、150 W）对4 种四环素萃取进行考察和分析，重复3 次取其平均值，确定适宜的提取条件。

1.5.6 方法学实验

样品加标回收率实验:取鸡肉6 份，向其中5 份加入浓度为50 μg/mL，10 mL 的混标准，按照1.5.2 实验步骤进行提取，按照1.5.2 实验步骤进行测定，计算样品加标回收率。稳定性试验:按照1.5.2 实验步骤对鸡肉中四环素进行提取，按照1.5.1 实验步骤进行测定，重复进样6 次，计算其RSD%。重现性实验:按照1.5.2 实验步骤进行，对鸡肉中的四环素进行平行提取6 次，并按照1.5.1 洗脱条件下进行测定。最小检测限试验:在最低检出浓度下测定6 次，根据3 倍的信号/噪声来计算4 种四环素的最小检出限。

2 实验结果与讨论

2.1 四环素分离及标准曲线的测定

2.1.1 4 种四环素分离效果

按照1.5.1 实验步骤，在此色谱洗脱的程序下，土霉素、四环素、金霉素、多西环素这4 种四环素得到比较好的分离效果。其中4 种四环素在12 min 都出峰完毕，且全部基线分离。

图1 4 种四环素分离效果图Fig.1 Four kinds of tetracycline separation diagram

2.1.2 工作曲线的测定

在1.5.1 实验步骤下测定DCC、CTC、TC 和OTC 线性方程。实验结果表明:在12 min 内能分别洗脱DCC、CTC、TC 和OTC。其线性范围为0.50～50 μg/mL，R≥0.995 2。其中DCC 的线性方程为Y=14.678X+8.632 1，R=0.998 7；CTC 的线性方程为Y=22.423X+27.087，R=0.995 2；TC 的线性方程为Y=11.303X+14.53，R=0.995 4；OTC 的线性方程为Y=1.3293X+1.851，R=0.995 3。

2.2 不同离子液体对4 种四环素萃取的影响

考察3种离子液体（[OMIn][PF6]、[OMIM]Br、[Bupy][BF4]）对DCC、CTC、TC、OTC 的萃取效果影响。结果如图2 显示，CTC、TC、OTC 和DCC 的经过3 种离子液体进行微萃取后，[OMIn][PF6]对四环素(TC)，多西环素(DCC)，金霉素(CTC)这3 种四环素的萃取效果最好，分别是0.20、0.58、0.49 μg/mL，但对土霉素(OTC)的萃取并不是最佳，综合以上萃取数据，采用分[OMIn][PF6]作为萃取剂。

图2 不同离子液体对4 种四环素萃取影响Fig.2 Effect of different ionic liquids on extraction of four tetracyclines

2.3 分散剂种类对4 种四环素萃取的影响

考察4 种分散溶剂（甲醇、丙酮、乙腈、乙醇）对土霉素、四环素、金霉素和多西环素的萃取效果的影响。实验结果如图3 显示，选择丙酮作为分散剂，离子液体的萃取效率最高，此时4 种四环素的检出量分别为0.54、0.61、0.26、0.26 μg/mL。因此，选择丙酮作为最佳分散提取剂。这个可能的原因是甲醇、乙醇、乙腈的极性比较大，丙酮的极性相对以上3 种分散剂来的小，4种四环素分散在丙酮中的效果比较好。

图3 分散剂种类对4 种四环素萃取影响Fig.3 Effect of dispersants on extraction of four tetracyclines

2.4 单因素实验

2.4.1 离子液体浓度的优化

考察不同的[OMIn][PF6]离子体积分数（1%，2%，3%，4%，5%）对土霉素、四环素、金霉素和多西环素的萃取效果。结果如图4 显示，当体积分数逐渐增加到3%，萃取效率会达到最高值。此时，4 种四环素的含量为0.48、0.73、5.23、3.35 μg/mL。因此[OMIn][PF6]离子体积分数最佳萃取浓度为3%为优。

图4 离子液体体积分数对4 种四环素萃取影响Fig.4 Effect of ionic liquid concentration on extraction of four tetracyclines

2.4.2 分散剂用量的选择

考察不同的丙酮分散剂用量（480、600、720、840、960 μL）对土霉素、四环素、金霉素和多西环素的萃取效果的影响。实验结果如图5 显示，当分散剂用量为720 μL 时，萃取效果最好，4 种四环素的检出量都达到最大，分别为0.59、0.47、15.46、9.29 μg/mL。因此分散剂丙酮用量是720 μL 为佳。

图5 分散剂用量对4 种四环素萃取影响Fig.5 Effect of dispersant dosage on extraction of four tetracyclines

2.4.3 萃取时间的优化

考察不同的萃取时间（5、10、15、20、25 min）对土霉素、四环素、金霉素和多西环素的萃取效果的影响。结果如图6 显示，当萃取时间为15 min 时，萃取效率最好，这个时候的四种四环素的检出量都达到最大，分别为0.50、0.56、0.66、1.39 μg/mL。但当时间超过15 min 时，萃取效率反而降低，这个可能是鸡肉中的4 种四环素经过超声辅助提取后慢慢溶解出来，当超声波时间为15 min 溶解达到最大，超过15 min 后，由于超声时间太久导致四环素被超声破坏，鸡肉中四环素含量降低。所以萃取时间为15 min 为优。

图6 超声时间对4 种四环素萃取影响Fig.6 Effect of ultrasonic time on extraction of four tetracyclines

2.5 方法学试验

样品加标回收率试验:取鸡肉6 份，向其中5 份加入浓度为50 μg/mL，10 mL 的混标准，按照1.5.2 实验步骤进行提取和测定，计算样品加标回收率。实验结果表明:4 种四环素的样品加标回收率在80.70%～112.10%时间。

稳定性试验: 按照1.5.2 实验步骤对鸡肉中四环素进行提取，按照1.5.1 实验步骤进行测定，重复进样6 次，计算其RSD 值为3.78%。重现性试验:按照1.5.2实验步骤进行，对鸡肉中的四环素进行平行提取6次，并按照1.5.1 洗脱条件下进行测定。计算其RSD值为1.32%。最小检测限试验:在最低检出浓度下测定6 次，根据3 倍的信号/噪声来计算4 种DCC、CTC、TC、OTC 的检出限分别在0.50、0.10、0.10、0.10 μg/mL。

表2 四种四环素的样品加标回收率（n=5）Table 2 The recoveries of four tetracycline samples were determined (n=5)

3 结论

利用[OMIN][PF6]离子液体和超声波辅助提取法从鸡肉中提取4 种四环素类抗生素（土霉素(OTC)、四环素(TC)、金霉素(CTC)、多西环素(DCC)），并采用高效液相色谱法测定DCC、CTC、TC 和OTC。实验结果表明:以浓度为3%萃取体积为450 μL [OMIN][PF6]提取剂，720 μL 丙酮为分散剂，超声提取时间为15 min。在最优的萃取条件下，用高效液相色谱法测定鸡肉4种四环素，发现DCC、CTC、TC 和OTC 未检出；在12 min 内分别洗脱DCC、CTC、TC 和OTC。DCC、CTC、TC和OTC 的检出限分别为0.50、0.10、0.10 和0.10 μg/mL。DCC 的线性范围为0.50～50 μg/mL，r≥0.995 2。实验结果表明:用高效液相色谱法能满足快速检测鸡肉中的DCC、CTC、TC 和OTC。