β-蜕皮甾酮对MPTP 诱导的帕金森病的体内保护研究

渠丽丽 张英博 董海影 刘得水 陈培培 张晓杰

齐齐哈尔医学院，黑龙江齐齐哈尔 161006

帕金森病（Parkinson’s disease，PD）是常见的神经退行性疾病，其特征是黑质多巴胺能神经元退化，纹状体多巴胺显著减少[1]。PD 最明显的症状表现为震颤、僵硬、动作迟缓、姿势不稳和行走困难[2]。研究显示，活性氧的过度产生、氧化应激[3]和线粒体功能障碍[4-5]是PD 发病的原因。因此，寻找可以缓解PD 症状及预防多巴胺能神经元变性的新药对于PD 的治疗很重要。近年来，中药及其中药单体成分对PD 的治疗或辅助治疗越来越受到人们的关注[6]。牛膝是一种传统的中草药，其水煎液具有抗氧化药理活性[7-8]。β-蜕皮甾酮是牛膝等几种中草药的主要成分。研究发现，β-蜕皮甾酮可清除自由基发挥抗氧化效应[9-10]，具有抑制脑组织脂质过氧化损伤的作用[11-12]。而激活PI3K/AKT 通路具有一定的抗氧化作用[13]。本研究拟采用MPTP 构建小鼠PD 模型，探讨β-蜕皮甾酮通过调节PI3K/Akt 通路保护多巴胺能神经元并减弱细胞凋亡机制。

1 材料与方法

1.1 材料

购买42 只C57BL/6 雄性小鼠，月龄8 周，体重为（20±2）g[辽宁长生生物，许可证号：SCXK（辽）2020-0001]。MPTP（美国SIGMA）；β-蜕皮甾酮（MCE）；司来吉兰（芬兰orion corporation）；PI3K（Affinit，批号：AF6241）；TH、P-PI3（CST，批号：58844S；4228T）；AKT、P-PAKT、BAX 及BCL-2（武汉三鹰，批号：60203、66444、50599、12789）；蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂、二抗（博士德，AR1192、AR1183、BA1054、BA1050）；BCA蛋白定量试剂盒（碧云天生物技术；批号：P0012S）；eECL 显影液（康为世纪，批号：CW0049S）；全自动凝胶成像系统（美国ABI）；实时荧光定量PCR 仪（美国ABI）。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组 按随机区组法对小鼠称重进行分组，后用随机数字表法将42 只小鼠分为正常组（A 组）、模型组（B 组）、司来吉兰组（10 mg/kg）（C 组）、β-蜕皮甾酮高（30 mg/kg）（D 组）、中（10 mg/kg）（E 组）、低（3 mg/kg）（F 组）剂量组，每组7 只，各治疗组于造模前分别用相应剂量药物进行灌胃，持续14 d，正常组与模型组分别用等量生理盐水灌胃。

1.2.2 模型制备 给予治疗药第10 天起，小鼠腹腔注射MPTP（30 mg/kg）[14]，连续注射5 d。造模后可见小鼠出现震颤、竖毛、弓背、后脚伸直、流涎等表现。

1.2.3 组织取材 小鼠处死，冰上快速取脑。

1.2.4 行为学观察 将小鼠固定在杆顶部，记录其从头到尾下落时间，每只小鼠测3 次，取平均值。将小鼠前爪放在电线中间，后肢悬空。评分标准：双后肢抓住绳索为0 分，一只后肢抓住绳索为1 分，双后肢均抓不住绳索为2 分。检测时间1 min，连测3 d 取平均值。

1.2.5 Western blot 取小鼠黑质，加裂解液冰上匀浆，涡旋混匀，离心（13 500 r/min，离心半径7.5 cm）吸上清。BCA 法测定蛋白浓度，于沸水中变性。取蛋白样品用10%SDS-PAGE 凝胶分离，转至PVDF 膜。5%脱脂牛奶封闭2 h，一抗孵育过夜，二抗孵育2 h，TBST 漂洗后显影。

1.2.6 RT-qPCR Trizol 法提取总RNA，逆转录试剂盒将总RNA 逆转录为cDNA，配置RT-qPCR 体系：SYBR Green 预混液10.4 μl，cDNA 2 μl，正反向引物各0.8 μl，灭菌水补足20 μl 体系。反应条件：预变性95℃30 s，40 个循环（95℃5 s，60℃31 s，95℃15 s）。置于荧光定量PCR 仪进行扩增。比较CT 法用于计算经GAPDH 标准化的基因表达变化。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.3 统计学方法

采用SPSS 26.0、Origin 2021 软件对所得数据进行统计分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差（）表示，采用t 检验或方差分析。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组行为学检测比较

B 组小鼠爬杆时间长于A 组，C、D、E 组小鼠爬杆时间短于B 组，差异有统计学意义（P＜0.05）；F 组爬杆时间与B 组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。B 组小鼠悬挂评分高于A 组，C、D、E 组小鼠悬挂评分低于B 组，差异有统计学意义（P＜0.05）；F 组悬挂评分与B 组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见图1。

图1 各组行为学检测比较（n=7）

2.2 β-蜕皮甾酮对蛋白表达的影响

2.2.1 TH 蛋白表达B 组TH 表达低于A 组，C、D、E 组TH 表达高于B 组，差异有统计学意义（P＜0.05）；F 组TH 表达与B 组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见图2。

图2 Western blot 检测小鼠黑质内TH 蛋白含量（n=7）

2.2.2 β-蜕皮甾酮通过PI3K/AKT 通路减弱MPTP致PD 小鼠的细胞凋亡B 组P-PI3K/PI3K 及P-PAkt/Akt比值低于A 组，C、D、E 组P-PI3K/PI3K 及P-PAkt/Akt比值高于B 组，差异有统计学意义（P＜0.05）；F 组P-PI3K/PI3K 及P-PAkt/Akt 比值与B 组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。B 组抑凋亡蛋白BCL-2表达低于A 组，促凋亡蛋白BAX 表达高于A 组，差异有高度统计学意义（P＜0.01）；C、D、E 组BCL-2蛋白表达高于B 组，BAX 蛋白表达低于B 组，差异有统计学意义（P＜0.05）；F 组BCL-2、BAX 蛋白表达与B 组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见图3～4。

图3 Western blot 检测小鼠黑质内P-PI3K、PI3K、P-Akt、Akt 蛋白含量（n=7）

2.3 BCL-2、BAX mRNA 的表达

B 组BCL-2 mRNA 表达量低于A 组，C、D、E 组BCL-2 mRNA 表达量高于B 组，差异有统计学意义（P＜0.05）。B 组BAX mRNA 表达量高于A 组，C、D、E组BAX mRNA 表达量低于B 组，差异有统计学意义（P＜0.05）；F 组BCL-2 及BAX mRNA 表达量与B 组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见图5。

图4 Western Blot 检测小鼠黑质内BCL-2、BAX 蛋白含量（n=7）

图5 PCR 检测小鼠黑质内BCL-2、AX mRNA 含量（n=7）

3 讨论

PD 是一种进行性神经退行性疾病，具有运动迟缓、静息性震颤和强直等症状[15]。PD 发病与环境、衰老和遗传因素有关，氧化应激和线粒体功能紊乱是散发型和家族型PD 多巴胺能神经元死亡的发病机制[16]。目前，PD 的主要药物治疗是通过左旋多巴补充多巴胺[17]。而多巴胺补充剂只能缓解疾病症状，不能减缓PD 进展，长期使用左旋多巴会导致致残波动和运动障碍[18]。

体外实验证实β-蜕皮甾酮对MPP+诱导的PD模型具有神经保护作用[19]，但体内经PI3K/Akt 通路是否有助于缓解PD 尚未阐明。此研究中，MPTP 体内诱导PD 小鼠模型，拟找出β-蜕皮甾酮对PD 治疗的影响。司来吉兰用作阳性对照药物评估β-蜕皮甾酮的相对治疗效果[20]。行为学实验中爬杆和悬挂实验是测量PD 小鼠运动迟缓、评估肌肉力量的有效方法，结果显示，β-蜕皮甾酮以剂量依赖式缓解PD 小鼠的运动迟缓和肌强直等症状。TH 一种合成多巴胺的限速酶，且研究表明TH 在PD 发病机制中起关键作用[21]。研究采用Western blot 检测TH 蛋白表达，结果显示，β-蜕皮甾酮以剂量依赖式上调TH 蛋白表达。研究发现激活PI3K/Akt 通路可减弱MPTP 诱导的氧化应激反应[22]，且经证实其可调节下游Nrf-2 信号[23]。Nrf-2 抗氧化反应调节因子，活化入核后可诱导下游超氧化物歧化酶、谷胱甘肽转移酶等Ⅱ相抗氧化解毒酶转录[24]，继而对抗氧化应激诱导的细胞凋亡和神经元坏死。促凋亡蛋白Bax 和抑凋亡蛋白Bcl-2 之间的平衡在调控细胞凋亡中起着重要作用[25]，研究显示，MPTP 可扰乱了Bax 和Bcl-2 之间的平衡[26]。本研究显示，中、高剂量β-蜕皮甾酮治疗减弱MPTP 引起的PI3K 和Akt 磷酸化的下调，并显著抑制促凋亡蛋白，增强抑凋亡蛋白表达。RT-qPCR 结果中各组小鼠Bcl-2与BAX mRNA 表达量进一步证实β-蜕皮甾酮以剂量依赖式改善由MPTP 诱导的PD 小鼠的细胞凋亡。

综上所述，β-蜕皮甾酮以剂量依赖式激活PI3K/Akt 通路改善MPTP 致PD 小鼠的神经元损伤并减弱细胞凋亡，继而保护多巴胺能神经元免受MPTP诱导的神经毒性。