骨碎补治疗骨质疏松症的实验研究进展

高文鑫 陈云刚 姚康 郝延科

1.山东中医药大学，山东 济南 250000 2.山东中医药大学附属医院，山东 济南 250000

骨质疏松症(osteoporosis，OP) 是以骨密度与骨量的下降, 骨组织微细结构退变为特征，导致骨质脆性的改变及人体全身骨代谢异常，因而常引起胸腰椎压缩骨折、髋关节细微骨折等骨科病的一种退变性疾病[1-2]。“骨质疏松症”这一病名在中医古籍中未有详细准确的记载，但由于其临床症状大多表现为全身，尤其是腰背局部的广泛性疼痛，且易发生细微骨折，与中医“骨痿”的临床症状较为相似，故常将其列为“骨痿”病的范畴[3]。骨碎补作为广泛应用于治疗骨痿的传统中药，味苦、性温，具有补肾强骨、活血止血的作用。现代药理研究[4]表明，骨碎补能增强成骨细胞的活性，下调破骨细胞的活性，具有促成骨形成和减缓骨吸收的双重作用。近年来，众多学者对于骨碎补治疗骨质疏松症的作用机制和信号通路做了大量的实验研究，但缺少系统的归纳与总结。本文将从骨碎补对间充质干细胞、成骨细胞和破骨细胞的作用及其对于骨质疏松症治疗的作用机制通路，对骨碎补治疗骨质疏松症的实验研究进展进行综述，旨在为下一步的临床研究和实验开展提供更为深入详细的理论指导。

1 骨碎补对于间充质干细胞、成骨细胞和破骨细胞的作用

在生理条件下，成骨细胞、破骨细胞和骨细胞作为骨组织中的三种关键和重要的细胞类型形成了复杂的通信网络，然而，过于活跃的成骨细胞介导的成骨活动或破骨细胞依赖性骨吸收导致骨质量或数量的病理学改变，从而出现骨质的硬化或骨质疏松症[5]。骨碎补作为总黄酮类的一种混合物，其结构多样、纯化困难，而柚皮苷属于黄酮类单体物质，称多甲氧基黄酮，具备分子结构清晰、相对分子质量小、易于提纯等特点。目前大部分实验结果表明柚皮苷有促进骨的形成、抑制破骨的发生、抗氧化、抗炎、保护神经等作用，而在促进成骨、抑制破骨等方面的研究最为广泛[6-8]。

1.1 骨碎补对间充质干细胞的作用

人类间充质干细胞是人体内的多能细胞，广泛存在于成人骨髓中，可以未分化的细胞的身份进行复制与增殖，同时也具备分化为间充质组织的多向诱导分化能力[9]。间充质干细胞具有很强的免疫调节作用，并且能够迁移到炎性组织和肿瘤细胞的位置，具有归巢效应，被认为是精确性和选择性地传递抗癌药物的有效载体[10]。近年来，随着在基因层面和免疫调节层面研究的更加深入，发现间充质干细胞可以产生具有向神经元提供治疗性RNA功能的外泌体，也可以通过直接的细胞-细胞接触或通过其分泌体与先天性免疫系统和适应性免疫系统的细胞进行强有力的相互作用[11]。

骨碎补中有效提取物柚皮苷可增强骨髓间充质干细胞的成骨作用[12]。王军松等[13]研究发现，骨碎补总黄酮可能通过激活Wnt/β-catenin通路从而促进β-catenin、Runx2的表达，抑制PPARG的表达来达到促进BMSCs的倍增反应和成骨分化的作用。周涵[14]在研究人牙周膜干细胞时发现，柚皮苷可以通过激活具有调节多种发育过程的分泌性信号传导通路Hedgehog信号通路，增强碱性磷酸酶活性和Runx2的表达，促进人牙周膜干细胞的成骨分化，但过高浓度(10 mg/L和100 mg/L)的柚皮苷长期作用后可能会抑制细胞的增殖分化，降低其在长时间内促成骨的作用。张虎林等[15]研究表明，不同剂量的骨碎补冻干粉(高剂量0.4 mg、中剂量0.1 mg、低剂量5 μg)可以诱导兔骨髓中的间充质干细胞向软骨细胞分化，诱导后的细胞可通过细胞免疫组化可以检测Ⅱ型胶原的表达，尤其以低剂量组效果最佳。以上研究表明，在不同的组织和细胞中，合适浓度的骨碎补可以通过不同的信号通路来增强间充质干细胞的成骨分化作用，但需要在合适的浓度内才能较好发挥作用，过高的药物浓度反而会抑制细胞的增殖和分化能力。

1.2 骨碎补对成骨细胞的作用

成骨细胞是起源于多能间充质干细胞的骨形成细胞，Runx2和Osx被认为是成骨细胞谱系的主调节因子[16]。同时，成骨细胞是构建骨骼的细胞，在其分化的所有阶段都需要严格调节，从而保证适当的骨骼发育和机体稳态[17]。成骨细胞衍生的血管内皮生长因子可以改善骨再生和治疗骨愈合缺陷，并有研究[18]发现，随着年龄的增长及骨量和骨血管的减少，血管内皮生长因子的水平明显下调，可能会导致骨质疏松症。

骨碎补提取物可通过调节多种代谢途径和骨调节因子的表达来影响成骨细胞的增殖与分化。宋渊等[19]研究发现骨碎补含药血清可明显提高细胞增殖率、血清碱性磷酸酶(ALP)活性，有效促进钙盐沉积、骨钙素分泌，提高钙化结节形成数量，从而证明骨碎补可有效促进成骨细胞的增殖与成骨分化。Ge等[20]进行实验证明柚皮苷通过激活PI3K/AKT/mTOR信号通路，促进成骨细胞自噬，增强细胞增殖与分化，有效提高骨密度。Shen等[21]将实验大鼠随机分配成接受牵拉成骨技术治疗组和常规骨折固定治疗组，发现口服骨碎补总黄酮类化合物的大鼠通过调控PDGF-BB/PDGFR-β信号通路加快具有促进骨的成血管-成骨耦联作用的CD31Emcn血管的形成，对成骨和血管形成具有积极的调节作用。Li等[22]发现骨碎补总黄酮化合物可以促进诱导膜中骨移植物的生长和矿化，促进成骨细胞的成熟与增殖。孟春力[23]的研究发现，骨碎补的乙醇提取物(浓度为0.02 g/mL)能对Runx2、OPN、OCN等成骨活性相关分子的表达有促进作用，增强成骨细胞的成骨活性，同时促进细胞周期的快速发展与增殖，这种调节过程可能与PI3K/AKT信号通路、ERK1/2信号通路的活化有关。通过上述体内和体外实验我们发现，骨碎补可能通过激活不同的信号通路促进细胞自噬、成骨及血管形成的过程，达到促进细胞的成骨和增殖分化的目的。

1.3 骨碎补对破骨细胞的作用

破骨细胞是多核巨细胞，其活性缺陷导致骨髓衰竭，过量活动会导致骨质流失甚至骨质疏松症，造成骨代谢紊乱[24]。破骨细胞在成人中是长寿的，并且它们的功能通过单个造血干细胞衍生的循环细胞与现有合胞体的迭代融合来维持[25]。数据表明，从亲本细胞衍生的破骨细胞凋亡体的功能性遗传显示了它们在骨重塑中的破骨细胞-成骨细胞耦合中的桥接作用，对缺陷性修复区域血管生成和骨再生具有重要的影响[26]。

骨碎补提取液可抑制破骨样细胞在骨髓体外培养时的分化增殖，通过抑制机制在破骨母细胞成熟转化的过程中起作用，但与药物浓度存在一定的联系[27]。张峻玮等[4]通过对去卵巢大鼠骨骼微细结构进行观察，发现骨碎补灌胃后可明显提高去卵巢大鼠的骨密度、骨小梁数量等骨的微细结构参数，调控破骨细胞的数量和活性水平明显下降，同时抑制对于骨组织结构的吸收，具有明显的骨保护作用。许金松等[28]通过对巨噬细胞向破骨细胞分化进行诱导的方法观察不同浓度骨碎补含药血清对巨噬细胞活性的影响，分析骨碎补总黄酮对破骨细胞分化成熟的作用。实验表明，巨噬细胞被不同浓度含药血清诱导分化后，各组与其余未经处理实验组相比，在破骨细胞数、融合指数等评价细胞分化水平的指标上明显减少，且降低程度与剂量呈正比关系，说明骨碎补含药血清抑制大鼠巨噬细胞分化为破骨细胞的过程存在抑制。童徐[29]将小鼠颅顶骨的骨组织放入不同浓度的柚皮苷培养基中进行培养，对其进行TRAP染色，发现随着实验时间的延长，实验组和对照组相比，着色的破骨细胞数量较前大幅度下降，且浓度为1 mg/L最为明显。Wang等[30]研究发现，柚皮苷通过促进T细胞释放IL-4来抑制RANKL诱导的破骨细胞生成和破骨细胞骨吸收。李风波等[31]研究结果表明，柚皮苷可通过降低破骨细胞表达基因 Bcl-2/BAX比值，加速破骨细胞的凋亡过程，从而减少成熟破骨细胞数目，降低破骨细胞的骨吸收能力，凋亡原理可能是通过抑制破骨细胞表达基因 Bcl-2，促进破骨细胞表达基因BAX，从而使BCL-2/降低，最终使 Caspase-3 活化，使破骨细胞进入无法逆转的凋亡。王琛[32]通过建立大鼠实验性牙周炎模型，对给予不同浓度柚皮苷标品的牙周组织病理切片进行观察，发现实验组中牙槽嵴顶的破骨细胞明显减少，且4 %柚皮苷组有良好的抑制破骨能力。

综上所述，骨碎补提取物对不同动物、不同组织的间充质干细胞的成骨分化，对成骨细胞的成骨活性、细胞分化与增殖等具有促进作用，同时可以有效抑制破骨细胞引起的骨吸收，从而达到维持骨代谢稳态、改善骨质疏松的作用。

2 骨碎补对于骨质疏松症治疗的作用机制通路

骨碎补可通过多条通路，从细胞的增殖、分化与机体的免疫反应、氧化应激反应等多个方面，对干细胞、成骨细胞、破骨细胞、免疫细胞等产生调节与平衡作用[33]，通过参与调控骨吸收与骨合成，调节机体内部骨代谢平衡，从而起到抗骨质疏松的作用。其中，有两大类信号通路被学者们广泛研究，一种是通过参与支配骨的形成、促进与骨形成相关信号蛋白的合成与释放的信号通路，其中有较为典型的三种，分别是BMP-Smads信号通路、Wnt/β-catenin通路及 MAPK 信号通路；另一种是通过抑制骨吸收，降低骨质流失，进而避免骨质疏松症发生的通路有OPG/RANKL/RANK 信号通路[34]。近年来，有一些实验研究表明，骨碎补亦可通过雌激素通路及Notch通路来达到改善骨质疏松、调节骨代谢平衡的作用。

2.1 参与调控骨形成的信号通路

2.1.1骨碎补对于BMP-Smads信号通路的调控：骨形态发生蛋白(BMP)属于转化生长因子(TGF)-β超家族成员，具有促进胚胎发育、调控出生后骨骼生长及重建再生、诱导软骨内骨形成、维持成体稳态平衡等作用[35]。Smads为BMP信号通路中的核心蛋白，对成骨细胞分化具有极为关键的影响[35]。BMP通过激活Smads蛋白进一步转位至细胞核内充当转录增强因子及调控相关转录因子核心结合蛋白影响成骨相关基因的转录，从而促进骨的形成。因此BMP-Smads 信号通路可以调控成骨细胞基因的表达，在调节成骨细胞的成骨速率及进一步的成骨分化过程中发挥重要的作用[36]。

沈智等[37]研究发现骨碎补总黄酮(6.75 mg/mL)能有效提高悬尾实验性骨质疏松大鼠细胞中BMP-2 mRNA的表达，从而起到抗骨质疏松作用。董航等[38]在研究载骨碎补总黄酮磷酸钙骨水泥对骨缺损模型大鼠诱导膜中成骨细胞分化的影响时发现，骨碎补总黄酮可明显促进大鼠骨缺损区新生骨细胞中BMP-2、Smad1、Smad4、Smad7等蛋白的表达，促进成骨细胞的成熟。Dong等[39]研究发现骨碎补及其标记化合物(柚皮苷)可以通过抑制BMP-2和BMP-1A的结合，阻断BMP-1A信号的传导，同时促进BMP-1B信号传导，诱导骨细胞形成，从而控制细胞分化，导致成骨，并通过动物实验证明骨碎补可能是骨组织工程的良好天然的BMP调节剂。通过以上研究结果可知，骨碎补可通过该通路的多个蛋白位点起作用，对具有骨诱导性的骨形态发生蛋白BMP-2作用尤为明显，有效促进成骨细胞成熟分化，参与骨和软骨的重建过程，进而加速骨缺损修复，有效改善骨质疏松症。

2.1.2骨碎补对于Wnt/β-catenin信号通路的调控：Wnts是一类高度保守的分泌型糖蛋白，可以调节干细胞的多能性，在细胞增殖、分化及凋亡等分化发育过程中发挥着重要的调控作用[40]。Wnt/β-catenin 信号通路又称为经典Wnt信号通路，Wnt/β-catenin信号通路通过β-catenin的核异位，激活靶基因的转录活性，干预间充质干细胞、成骨细胞以及破骨细胞等骨组织细胞的增殖及分化，广泛参与骨代谢的调控[41]。

李琰等[42]对去卵巢骨质疏松大鼠进行骨碎补水煎液灌服处理后观察大鼠骨髓间充质干细胞向脂肪细胞分化的调节作用时发现，经骨碎补水煎液灌服后大鼠BMSCs中Mnt10b、β-catenin、LRP5等基因表达显著升高，LPL和PPARγ基因表达显著下降，说明骨碎补可通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进间充质干细胞的成骨分化，抑制其成脂分化。李晋玉等[43]在实验中运用Wnt通路抑制剂DKK1，发现DKK1+骨碎补总黄酮组和DKK1+转化生长因子β-catenin、LRP5、RUNX2、CyclinD1基因及蛋白表达明显增加，且骨碎补总黄酮诱导的基因及蛋白表达水平与药物剂量之间存在正比关系。陈云刚等[44]研究发现骨碎补含药血清可明显促进BMSCs的增殖，提高ALP的活性和矿化结节数，同时发现BMSCs经成骨诱导7 d后β-catenin、LRP5、RUNX2及Osterix mRNA的表达明显上调，GSK-3β的表达显著下调，胞质中β-catenin、LRP5的蛋白表达水平升高，表明骨碎补含药血清可能通过激活Wnt/β-catenin 信号通路来实现BMSCs的成骨分化。以上实验证明，骨碎补可通过激活Wnt/β-catenin 信号通路来诱导成骨细胞的增殖分化，从而有效治疗骨质疏松症。

2.1.3骨碎补对于MAPK信号通路的调控：MAPK信号通路是调控成骨细胞生长、增殖分化的重要途径，在众多MAPK 信号转导通路中，ERK、p38 和 JNK 信号通路在细胞成骨分化中发挥着核心的作用[45]。EPK1和EPK2的许多底物参与控制细胞增殖、分化、存活和死亡的关键生理过程，维持细胞稳态[46]。p38是一种多任务激酶，通过与大量底物相互作用来调节细胞增殖、细胞分化、细胞应激反应、细胞凋亡以及细胞迁移和存活等，具有控制细胞周期进展的能力[47]。JNK信号通路具有调节细胞凋亡和存活的双面性，可以诱导自噬来抑制癌细胞的凋亡[48]。

张力等[49]研究表明骨碎补总黄酮可加快成骨相关因子核结合因子α1 mRNA、碱性磷酸酶mRNA的转录，加入p38抑制剂SB203580后可使两者表达明显降低，说明骨碎补总黄酮可能通过MAPK/p38信号通路提高成肌细胞与成骨细胞之间的分化。齐鹏飞等[50]发现在模拟失重状态下，骨碎补总黄酮可升高MAPK/ERK磷酸化水平，逆转失重对细胞的影响，促进细胞中出现较高的碱性磷酸酶表达，进而促进间充质干细胞分化为成骨细胞，这可能与激活MAPK/ERK信号通路有关。以上研究表明，骨碎补总黄酮可能通过激活MAPK/p38和MAPK/ERK信号通路来促进成骨细胞的分化。

2.2 参与调控抑制骨破坏的信号通路

骨碎补对于OPG/RANKL/RANK信号通路的调控：OPG/RANKL/RANK系统以其在破骨细胞成熟、骨骼生长和骨重塑中的作用而闻名，NF-κB(RANK)的受体激活剂、NF-κB配体(RANKL)的受体激活剂和骨蛋白(OPG)是该信号系统的主要成分。OPG是特异性骨形成分泌蛋白，它与RANKL结合，发挥抗破骨细胞生成作用[51]。OPG作为RANKL的诱饵受体，参与抑制RANKL与RANK结合[51]。

张峻玮等[52]对实验大鼠使用骨碎补水煎液灌胃处理后提取骨髓间充质干细胞与破骨细胞共同培养，发现骨碎补水煎液灌胃处理后OPG蛋白表达上升，RANKL及RANKL/OPG蛋白表达下降，说明骨碎补通过调节OPG/RANKL/RANK信号通路来起到抑制破骨细胞分化成熟的作用。刘康等[53]发现不同浓度骨碎补总黄酮可使去卵巢骨质疏松大鼠血清雌二醇及OPG水平上调，RANKL及RANK水平明显下降，从而达到减少破骨细胞的生成、抑制破骨细胞活化的目的。曾辉等[54]研究表明骨碎补总黄酮可使骨质疏松大鼠下颌骨骨髓腔缩小，骨小梁间隙减小，同时通过调节大鼠血清OPG水平及OPG/RANKL比值，从而达到抑制下颌骨破坏吸收、防治下颌骨骨质疏松的作用。以上研究表明，骨碎补总黄酮可能通过激活OPG/RANKL/RANK信号通路来抑制破骨细胞的分化成熟，从而起到防治骨质疏松症的作用。

2.3 骨碎补对于雌激素水平的调控

Wu等[55]实验证明柚皮苷增强了雌激素受体(ERα)向细胞核的易位及其反式激活活性，增加了具有骨缺陷的小鼠受损部位的ERα和ALP水平，同时提高了愈合率和骨强度。柚皮苷可以通过调节ERα依赖性ALP基因表达来改善成骨细胞矿化和骨愈合。Song等[56]的研究表明，柚皮苷可与雌激素受体结合，提高促进血管生成的关键因子VEGF的表达，从而促进基质中的增殖和粘附，通过调控骨质疏松大鼠的VEGF/VEGFR-2信号通路的方式来影响血管生成、促进骨折愈合。雌激素水平的快速下滑是影响绝经后妇女骨质疏松较为突出的因素之一，对于骨碎补与雌激素信号通路的关系尚在研究中，但以上研究为我们提供了思路，说明骨碎补总黄酮可能通过雌激素受体激动机制来调节骨代谢的平衡水平。

2.4 骨碎补对于Notch信号通路的调控

Notch受体家族包括4种类型的受体，分为Notch1、Notch2、Notch3和Notch4，在细胞分化和功能中起关键作用，其中Notch1和Notch2在机体整个发育过程中和成年哺乳动物中的许多组织中广泛表达[57]。Notch信号传导控制破骨细胞分化和骨吸收活性，要么直接作用于破骨细胞前体，要么间接作用于成骨细胞谱系的细胞和免疫系统的细胞[58]。

黄敏玲等[59]研究发现，骨碎补总黄酮可促进大鼠骨组织中血管内皮生长因子、CD31、Hes-1、BMP-2、Notch-1的表达，这可能与骨碎补总黄酮激活Notch通路从而促进成骨-成血管耦联、促进骨组织的修复有关。黄翔宇等[60]发现JaggedⅠ(Notch配体)联合去甲酸及骨碎补可下降Notch-1、Hes-1 mRNA和蛋白的表达，抑制Notch信号通路，改善骨质疏松。韩亚力等[61]骨碎补总黄酮可以提高血钙和血磷水平，降低Notch-1、Hes-1 mRNA蛋白的表达，同时体外实验发现骨碎补总黄酮可以下调去甲酸所致的大鼠骨髓基质细胞Notch-1、Hes-1 mRNA和蛋白水平的升高，从而调节骨代谢平衡，这可能与对于Notch信号通路的抑制有关。

近年来，针对药物通过调控Notch信号通路来治疗骨质疏松症的实验研究日益增多。国外有研究[62]指出一种可溶性的骨靶向融合蛋白D114激活Notch信号传导，提高细胞成骨能力，促进小鼠的骨形成，且不会导致不良反应。国内在此方面的研究以单味中药为主，尤以对于淫羊藿的研究为多。有研究表明，淫羊藿发挥抗骨质疏松疗效主要是与其对Notch通路具有活化或抑制的双重作用有关[63]。鉴于目前国内对于骨碎补通过调控Notch信号通路来治疗骨质疏松症的实验研究较少，且实验结论上存在较大差异，因此，结合与骨碎补同为补肾强骨类中药淫羊藿的研究结果，能够为进一步研究探讨骨碎补对Notch信号通路是否具有双向调节作用，明确其基本作用机制具有重要的思路借鉴和理论指导，同时，也为骨碎补治疗骨质疏松症的机制研究提供了新的思路和方向。

3 结语

如何有效防治骨质疏松、调节机体内部骨代谢平衡水平的临床实验研究一直是医学研究的热门话题，尤其是近年来对于传统中药如何有效防治骨质疏松、调节机体内部骨代谢平衡水平的临床研究取得较为显著的成果，其中骨碎补作为补肾强骨、活血化瘀类中药的代表，对于其有效成分和作用机制研究更是成为热点。大量实验研究表明，在细胞分子水平，骨碎补可以通过调节间充质干细胞、成骨细胞和破骨细胞的分化水平来有效防治骨质疏松，但针对不同的细胞组织哪种浓度的骨碎补提取物效果最佳尚未得出明确的结论；在通路机制水平，骨碎补总黄酮可以通过作用于不同的通路机制来起到防治骨质疏松的作用，但具体通过哪种类型的通路起到最佳的治疗效果尚未明确，尤其是对于激活还是抑制Notch信号通路来起作用尚需进一步研究，而且不同分子通路之间的相互作用需要进一步明确。另外，骨碎补总黄酮是由多种化合物混合而成，需要进一步纯化有效成分，才能更有针对性治疗骨科各类疾病。同时骨碎补总黄酮在以往的研究中多关注在防治骨质疏松症方面，近年来又发现它在促进周围神经再生作用、促进骨内血管再生、改善骨内血管微循环、抗炎止痛作用等方面的优势，这一发现为骨碎补总黄酮在临床治疗中的应用开辟了更为全面的研究方向。