中医药介导Wnt/β-catenin信号通路防治骨质疏松的研究进展

翟柏宇 谢兴文 李鼎鹏 郭云龙 潘胜强 刘静

1.甘肃中医药大学，甘肃 兰州 730030 2.甘肃中医药大学附属医院，甘肃 兰州 730030 3.甘肃省第二人民医院，甘肃 兰州 730030

骨质疏松症(osteoporosis，OP)是一种全身性代谢性骨病，以骨组织微结构退化、骨量减少和骨质量降低为特征，其发病机制则是由破骨细胞介导的骨吸收多于成骨细胞介导的骨形成引起的骨重塑失衡[1]。截至2019年，我国OP流行病学调查显示50岁及65岁以上人群OP患病率分别为19.2%和32.0%[2]。OP不仅会降低生命质量，且由于其高致残率、高致死率给患者及社会也带来了沉重的经济负担[3]。大量研究表明，Wnt/β-catenin信号级联反应可促进间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)成骨分化及其相关因子表达，并抑制破骨细胞分化及其活性，达到维持骨重塑平衡的目的[4]。OP在我国传统医学中无准确定义，属于“骨痿”“痿证”等范畴，中医药防治OP历史悠久，确有疗效，且具有多通路、多靶点协同治疗的特点。本文将通过阐明Wnt/β-catenin信号通路在OP发病中的分子机制，深入研究中医药基于该信号通路防治OP的作用及其分子机制。

1 Wnt/β-catenin信号通路在OP发病中的作用

Wnt/β-catenin信号通路即“经典”Wnt途径，其核心是调节转录因子β-catenin的蛋白酶体降解[5]。激活该通路关键在于增加β-catenin在细胞质中的稳定性和积累，促进β-catenin进入细胞核，使胞内稳定的β-catenin通过与T细胞因子/淋巴样增强因子(TCF/LEF)结合来促进相关靶基因的转录及表达[4,6]。

Wnt/β-catenin信号通路在调节骨重建机制中扮演着重要角色。骨重建失衡被认为是OP的主要病理机制，即破骨细胞介导的骨吸收多于成骨细胞介导的骨形成。骨骼在整个生命中代谢活跃，经历持续的重建。骨重建体系调控严格，包括骨吸收周期和骨形成周期，即破骨细胞(osteoclast，OC)去除矿化的骨(骨吸收)，然后通过成骨细胞(osteoblast，OB)形成骨基质，随后被矿化(骨形成)，从而确保骨骼微损伤的修复(靶向重建)，并用新骨取代旧骨。骨吸收和骨形成的周期紧密耦合，每个骨形成周期后紧随下一个骨吸收周期，以保持骨骼完整性[7]。

1.1 Wnt/β-catenin信号通路对成骨分化的影响

随着分子生物学的快速发展，人类和小鼠的遗传学研究已经将Wnt/β-catenin信号通路确立为刺激成骨分化的关键机制，在实现骨量峰值中起着关键作用，可影响MSCs向OB谱系的定向分化以及OB合成骨基质的代谢能力[8]。

β-catenin在决定MSCs分化方面起着重要作用。当β-catenin缺乏时，MSCs则会向软骨细胞方向分化，而无法分化为成骨细胞，进行骨钙素表达[9]。Holmen等[10]通过实验观测到，β-catenin缺陷小鼠会出现成骨细胞比例显著降低和破骨细胞数量增多，使骨量总值严重减少，而β-catenin突变体表现出骨过度生长。

在经典的Wnt配体中，Wnt3a、Wnt6和Wnt10在促进成骨分化中发挥着重要作用。对基因敲除和转基因小鼠的观测中发现，Wnt10b可促进成骨分化并增加骨量[11]。体外研究表明，Wnt6、Wnt10a和Wnt10b抑制间充质干细胞向脂肪细胞的分化，并通过Wnt/β-catenin信号通路刺激MSCs成骨分化[9,12]。Wnt3a可激活Wnt信号或β-catenin/TCF4过表达，从而在启动子和基因水平刺激骨形态发生蛋白-2(BMP-2)的转录，证实Wnt/β-catenin信号通路可上调BMP-2表达，促进成骨细胞分化[13]。这些结果表明，Wnt/β-catenin信号通路对于MSCs向OB系细胞分化至关重要。

1.2 Wnt/β-catenin信号通路对破骨分化的影响

破骨细胞祖细胞向破骨细胞的分化受到成骨细胞和骨细胞的严格调控。成骨细胞和骨细胞分别表达核因子κB受体活化因子配体(RANKL)和巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)，而破骨细胞祖细胞表达的集落刺激因子受体(c-Fms)和核因子κB受体激活因子(RANK)，分别是M-CSF和RANKL的受体，促进破骨细胞祖细胞分化为破骨细胞[14]。此外，成骨细胞和骨细胞分泌骨保护素(Osteoprotegerin，OPG)是关键破骨细胞分化因子RANKL的诱饵受体，可抑制RANKL-RANK相互作用以抑制骨吸收[15]。

成骨细胞系细胞中Wnt/β-catenin信号通路的激活可增强OPG表达并抑制破骨细胞分化[15-16]。研究发现[17]，Wnt3a可通过结合FZD和LRP5/6受体复合体，抑制GSK-3β，促进成骨细胞内β-catenin的积聚，积聚的β-catenin转位到细胞核内，与TcF/LEF一起诱导OPG的表达，从而抑制骨吸收。因此，Wnt3a可通过由成骨细胞介导OPG/RANK/RANKL途径抑制破骨分化。研究表明，Wnt16可激活成骨细胞中的Wnt/β-catenin信号通路，通过提高OPG表达抑制破骨细胞分化[18]。除了通过控制成骨细胞/骨细胞的OPG表达和分泌来间接影响破骨细胞的形成外，Wnt16还可直接刺激破骨细胞前体，抑制RANKL诱导的核因子-κB(NF-κB)和活化T细胞核因子1(NFATC1)的激活，通过直接抑制RANK信号抑制破骨细胞分化[19]。此外，Wnt/β-catenin信号还可通过下调TRAP、组织蛋白酶K及MMP-9 mRNA的表达，抑制单核/巨噬细胞Raw264.7(破骨细胞前体)分化成熟为破骨细胞[20]。上述研究表明，Wnt/β-catenin信号通路影响破骨分化的机制主要是间接影响成骨细胞介导的OPG/RANK/RANKL途径和直接干预破骨细胞前体分化。

2 中医药介导Wnt/β-catenin信号通路防治OP

2.1 中药单体

中药淫羊藿在防治OP中应用广泛，研究深入。淫羊藿苷(Icaritin)是从其中提取的一种活性黄酮苷，在调节BMSCs的成骨分化，预防骨质流失和促进骨再生方面具有潜在的应用[21]。Wei等[22]通过淫羊藿苷干预大鼠骨髓基质细胞发现，淫羊藿苷可通过刺激β-catenin的活化，增加总β-catenin和核易位，显著上调Wnt信号成员(β-catenin、Lef1、TCF7、C-jun、C-myc和Cyclin D)的表达，进而促进成骨基因(Runx2、骨钾素、DLX5、骨钙素、Ⅰ型胶原蛋白和ERα)表达，通过激活ERα-Wnt/β-catenin信号通路，从而促进BMSCs增殖及成骨分化。Gao等[23]通过体外实验发现，淫羊藿苷可通过调控Wnt/β-catenin通路，上调Runx2，β-catenin和c-myc在内的成骨基因以及抗氧化因子Prdx1、Cata和Nqo1，增强ALP活性和钙结节的形成，促进BMSCs原位增殖和成骨分化，从而有效防治OP。淫羊藿总黄酮具有促进成骨分化及骨形成作用。肖文剑等[24]通过淫羊藿总黄酮干预去卵巢骨质疏松模型(ovariectomized，OVX)大鼠的研究中发现，淫羊藿总黄酮可显著上调，改善大鼠骨密度，提示淫羊藿总黄酮可能通过激活Wnt/β-catenin信号通路及OPG/RANK/RANKL途径，达到促进骨形成，抑制OC分化的目的。

牛膝作为传统补肝肾、强筋骨的中草药，在防治“骨痿”“痿证”中应用广泛。牛膝多糖(achyranthes bidentata polysaccharide，ABP)是从牛膝中提取的一种生物活性多糖。杨豪等[25]通过牛膝多糖干预骨质疏松性骨折大鼠，观察到骨质疏松性骨折大鼠骨小梁增多，骨密度增强，其机制可能是牛膝多糖通过上调β-catenin、Runx2、Osterix的基因表达，调控Wnt/β-catenin信号通路，促进成骨细胞分化，改善骨代谢。

葛根素(Puerarin)是从葛根中提取的一种异黄酮，葛根是一种用于治疗骨质疏松症等多种疾病的传统中草药。李兰[26]通过中药活性成分葛根素干预OVX大鼠，观察葛根素通过Wnt4/β-catenin通路在绝经后骨质疏松的影响。研究表明，葛根素还可抑制可溶性卷曲蛋白2(sFRP2)表达进而上调骨质疏松骨组织中Wnt4/β-catenin信号转导通路因子Wnt4、β-catenin、TCF1、Cyclin D1、C-myc的表达，抑制OC增殖，进而延缓骨质疏松症发生发展进程。罗智等[27]通过葛根素干预成骨细胞体外增殖及Wnt/β-catenin通路相关因子表达中观测到，葛根素可显著上调Wnt1、Wnt2、Wnt3a、Wnt10b、β-catenin的表达，通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进成骨细胞分化和增殖。上述结果表明，葛根素可通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进成骨细胞分化和抑制破骨细胞增殖。

白藜芦醇(resveratrol，RES)是虎杖、藜芦等中药的有效活性成分之一，具有类雌激素效应，是一种天然植物雌激素。喻琴云等[28]通过白藜芦醇介导Wnt/β-catenin通路干预OVX大鼠中得出结论，白藜芦醇可通过刺激Runx2的表达，下调Gsk3β的表达水平，使β-catenin的降解复合体无法有效形成，进一步确保β-catenin在细胞质中稳定积累，并向细胞核移位，从而激活Wnt/β-catenin通路，促进成骨分化，增强骨密度，起到防治OP的作用。

此外，骨碎补[29]、杜仲醇[30]、蛇床子素[31]、老鹳草素[32]等可通过激活Wnt/β-catenin通路，促进BMSCs增殖及分化、抑制破骨细胞活性，从而有效防治OP。

2.2 中药复方

中医经过长期临床实践得出“左归丸滋肾阴，右归丸补肾阳”的理论总结[33]。左归丸具有滋阴补肾的功效，长期临床实践发现，左归丸在防治绝经后骨质疏松症中疗效显著[34]。动物实验研究发现，左归丸可通过刺激Wnt2、LRP5表达，下调GSK3β的表达水平，确保β-catenin积累和核移位，使Wnt/β-catenin信号级联反应发挥效应，并可上调雌激素水平，改善骨骼生物力学性能及形态，使骨吸收和骨形成周期紧密耦合，恢复骨代谢平衡，确保骨骼的靶向重建[35]。章建华等[36]实验发现，右归丸含药血清可上调肾阳虚型去卵巢骨质疏松症大鼠成骨细胞中β-catenin、ERK1、ERK2 mRNA及蛋白表达，促进成骨细胞增殖，提示右归丸防治肾阳虚证OP的机制可能与Wnt/β-catenin、ERK1/2信号通路密切相关。对加味身痛逐瘀汤的研究中也有发现，加味身痛逐瘀汤可上调Wnt、Wnt1、β-catenin、Cyclin D1蛋白表达，提高骨质疏松症大鼠的骨密度以及改善骨组织形态[37]。此外，中药成方益肾健脾方能够上调肾组织Wnt3a、β-catenin mRNA及其蛋白水平，提高OPG、BMP-7并降低ALP、TrACP的血清水平，增强去卵巢骨质疏松症大鼠的骨密度，表明益肾健脾方防治OP的机制，可能是通过干预Wnt/β-catenin通路，起到改善骨组织形态及恢复骨平衡的作用[38]。

除上述诸方以外，其他中药复方如陇中损伤胶囊[39]、生髓健骨胶囊[40]、地黄饮子[41]等均能够干预Wnt/β-catenin通路介导防治骨质疏松。

2.3 针灸

针灸在治疗“骨痿”“痿证”等疾病中疗效显著，可有效改善其临床症状，达到较好的治疗效果。Fan等[42]研究发现，电针大鼠“关元”穴可显著上调β-catenin、Wnt3a和Runx2的表达水平，影响绝经后骨质疏松症大鼠的骨形成和骨代谢，该研究表明电针“关元”穴防治OP机制可能与Wnt/β-catenin通路密切相关。Zheng等[43]研究发现，电针大鼠“脾俞”“肾俞”“命门”及“脊中”穴可激活LRP5、β-catenin和Runx2的表达，提高血清雌二醇(E2)和骨钙素的血清水平，降低TRACP 5b的血清水平，并有效改善大鼠腰椎骨密度。表明在“脾俞”“肾俞”“命门”及“脊中”穴位长期电针治疗能够通过调节Wnt/β-catenin信号通路来缓解绝经后骨质疏松症。王亚军等[44]研究发现，针刺OVX大鼠“肾俞”“脾俞” “三阴交”和“足三里”穴，可上调其股骨和胫骨中Wnt3a和β-catenin的表达水平，激活Wnt/β-catenin信号通路，恢复骨重建平衡。综上，Wnt/β-catenin信号转导机制已成为针灸靶向治疗OP的重要途径。

艾灸是针刺的重要辅助疗法，与针刺相辅相成。研究指出[45]，艾灸“关元”“三阴交”穴位可刺激大鼠BMSCs成骨分化，并促进BGP表达。其机制可能是通过上调Wnt3a、β-catenin和TCF mRNA及BMSCs中的LRP5、LRP6 mRNA的水平，激活Wnt/β-catenin通路，从而促进骨髓间基质细胞成骨分化及增殖。该研究探讨了艾灸防治OP的内在机理，为OP的辅助疗法提供了新的理论依据。

综上所述，Wnt/β-catenin信号通路在骨重建的动态平衡中发挥着重要作用。作为OP发病机制中重要的细胞信息传导途径之一，该通路通过在细胞核中激活β-catenin，影响MSCs向成骨细胞定向分化，刺激BMP2的转录，促进成骨细胞增殖及分化，影响骨形成。此外，通过上调OPG的表达和下调RANKL的表达来间接抑制破骨分化及直接抑制破骨细胞前体分化，进而影响骨吸收，达到骨重建平衡。

中医药在防治OP方面历史悠久，疗效显著。综上总结可发现，中药单体、中药复方及针灸等疗法可通过调控Wnt配体、β-catenin、Runx2、C-myc和Cyclin D等上游因子表达，激活Wnt/β-catenin信号通路，促进OB增殖分化和抑制OC的增殖，达到治疗OP的目的，为中医药靶向治疗OP提供了研究方向。然而，现阶段中医药防治OP的相关研究仍体现出部分不足：(1)在分子机制研究中，仅以信号通路及OP相关指标为标准，忽视了中医证型的重要性；(2)缺乏对具体中药复方防治OP的多通路研究，不能更好地发挥中医药多通路、多靶点的治疗优势。因此，在今后的研究中，应以Wnt/β-catenin信号通路为支点，深入研究中医药防治OP的分子机制，并对涉及单一复方的所有通路进行研究总结，从而挖掘更多OP治疗手段，为中医药防治OP提供更多思路。