高龄女性卵子微环境的代谢组学研究进展

甘冬英，周红

高龄不孕女性生育力下降主要表现为卵巢储备功能和卵子质量降低。卵巢储备功能降低表现为基础窦卵泡数减少、抗苗勒管激素水平下降及基础卵泡刺激素（basic follicle-stimulating hormone，bFSH）水平升高等。卵子质量降低表现为妊娠率下降、流产率增加等。因此，年龄相关性不孕已成为生殖医学研究的热点问题，但卵子衰老机制尚不明确。高龄女性生殖功能减退伴随卵子微环境代谢物改变，涉及葡萄糖、脂质、蛋白质等，影响卵子的发育、成熟、受精等[1]。因此，卵子微环境代谢组学分析可筛选出与卵子质量及数量下降相关的代谢物，探索年龄相关生殖功能减退的实质，为改善体外受精-胚胎移植结局提供理论依据。

1 糖代谢

糖是体内的主要供能物质，葡萄糖是卵丘卵母细胞复合体（cumulus oocyte complex，COC）产生腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）的重要代谢物。在COC中，葡萄糖的代谢途径包括无氧氧化、有氧氧化、磷酸戊糖途径、己糖胺生物合成途径等。大部分葡萄糖通过有氧氧化途径提供能量。磷酸戊糖途径提供COC成熟过程中DNA合成所需的嘌呤、核酸和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）等，为卵母细胞核和细胞质的成熟提供底物。己糖胺生物合成途径在细胞外基质扩张和O-连接蛋白糖基化过程中为透明质酸的生成提供底物。因此，葡萄糖代谢在卵子成熟过程中起重要作用[2]。

1.1 糖的无氧氧化糖的无氧氧化分为糖酵解和乳酸生成2个阶段。在COC中，由于卵子缺乏胰岛素调节的高亲和力葡萄糖转运体和糖酵解的限速酶磷酸果聚糖酶，糖酵解几乎全部在卵丘细胞中进行。卵丘细胞代谢葡萄糖，产生丙酮酸和乳酸盐等代谢物，这些分子通过缝隙连接输送至卵子[2]。丙酮酸和乳酸是糖无氧氧化的重要代谢物，丙酮酸通过乳酸脱氢酶生成乳酸。对牛的大、小卵泡研究发现，小卵泡氧含量较低，葡萄糖快速代谢产生乳酸，导致卵泡液乳酸堆积，损害卵子发育[3]。采用高分辨率1H-核磁共振波谱对超过40岁和25～35岁的女性卵泡液进行研究，发现超过40岁女性的卵泡液葡萄糖水平降低，乳酸水平升高。这与卵巢颗粒细胞葡萄糖摄取、乳酸脱氢酶和磷酸果糖激酶基因表达增加有关[4]。高龄女性糖的无氧氧化增加，导致葡萄糖利用率下降，可能通过上调糖酵解的相关基因表达，增加线粒体自噬及促凋亡蛋白表达，从而降低卵子发育潜能[5]。

1.2 糖的有氧氧化卵子生长过程中，卵丘细胞及卵子共同合作完成糖的有氧氧化。卵丘细胞产生丙酮酸输送至卵子。丙酮酸在线粒体转化为乙酰辅酶A，乙酰辅酶A通过三羧酸循环和电子传递链生成ATP（ATP生成的主要途径）。卵子上调卵丘细胞的糖酵解基因以确保自身丙酮酸的需求。葡萄糖通过三羧酸循环和氧化磷酸化提供大量ATP，对卵泡正常生长和发育是必不可少的[2]。随着年龄增长，女性机体抗氧化能力逐渐下降，活性氧（reactive oxygen species，ROS）堆积。卵子线粒体长期暴露于ROS，线粒体突变和功能异常的可能性增加，导致ATP产生减少，影响卵子质量[6]。

高龄女性可补充脱氢表雄酮激活能量代谢的关键转录因子活性，进而调控下游生物发生相关基因，上调糖酵解基因表达，增加线粒体氧化磷酸化，增强细胞能量代谢。富含能量的细胞因衰老引起的程序性细胞死亡（如线粒体自噬、凋亡等）减少[7]。线粒体营养物质辅酶Q10是一种随着年龄增长而下降的脂溶性电子转移剂，给高龄小鼠补充辅酶Q10可延缓卵巢储备减少，修复卵巢线粒体基因表达，提高线粒体活性[8]。虽然使用线粒体营养素听起来很吸引人，但其临床效果仍需进一步研究。

1.3 磷酸戊糖途径磷酸戊糖途径是一条参与机体多种代谢反应、多种物质信息传递的代谢途径，由氧化阶段和基团转移反应阶段组成。磷酸戊糖途径除了受葡萄糖-6-磷酸脱氢酶制约外，还受细胞内NADPH的调节[9]。NADPH在6-磷酸葡萄糖氧化为6-磷酸葡糖酸内酯的过程中产生。NADPH为脂质和氨基酸的合成提供供氢体，并且是卵子发育过程中的主要还原剂之一，如可用于维持谷胱甘肽（glutathione，GSH）的还原状态[2]。在猪卵子体外成熟过程中，抑制磷酸戊糖途径后NADPH减少，GSH水平显著降低，ROS水平增加，这说明磷酸戊糖途径在维持高水平GSH和低水平ROS中发挥重要作用[5]。高龄小鼠卵子内NADPH比年轻小鼠低[10]，这可能是高龄女性卵泡液磷酸戊糖途径代谢异常导致GSH还原酶和过氧化氢酶水平下降的原因[11]。此外，磷酸戊糖途径代谢物嘌呤核苷酸调节减数分裂进程，NADPH调节卵子促成熟因子活性，共同参与卵子成熟[5]。如果抑制磷酸戊糖途径，则降低卵子质量，促进细胞凋亡，降低囊胚形成率[12]，这或许是高龄女性卵子非整倍体率增加的原因之一。

2 脂代谢

脂质包括三酰甘油、胆固醇和磷脂等。三酰甘油储存于卵子中，是卵子最丰富的脂质之一，占脂质的50%以上，是卵子巨大的能量储备，用于线粒体β氧化产生能量。另外，胆固醇和磷脂的浓度是卵子受精后快速分裂形成膜的关键因素。因此，卵子微环境脂质改变会影响卵子的能量代谢和发育[13]。

2.1 三酰甘油在排卵期间，卵子排出极体、颗粒细胞增殖、卵丘细胞产生基质等均是能量消耗的过程。三酰甘油通过脂肪动员生成甘油及脂肪酸。卵子通过线粒体氧化游离脂肪酸，增加能量消耗，这是一种比糖代谢更有效的ATP来源，如一分子葡萄糖氧化产生30或32个ATP，而等量脂肪酸棕榈酸酯氧化却产生106个ATP。COC的游离脂肪酸来自卵泡液摄取或细胞脂质分解，后经肉碱脂酰转移酶Ⅰ进入线粒体转化为乙酰辅酶A。经β氧化产生的乙酰辅酶A进入三羧酸循环彻底氧化生成ATP，产生的还原型黄素腺嘌呤二核苷酸（reduced flavin adenine dinucleotide，FADH2）和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 （reduced nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）经呼吸链氧化，与腺苷二磷酸（adenosine diphosphate，ADP）磷酸化耦联生成ATP[2]。如果卵泡液中游离脂肪酸过多，产生毒性，会导致COC形态发育不良，影响卵子的核成熟[14]。反之，如果游离脂肪酸过少，则β氧化底物不足，亦影响卵子发育潜能[15]。与体内成熟的COC相比，体外成熟的卵子和卵丘细胞的β氧化水平均降低，可能体外培养的COC缺乏左旋肉碱，导致β氧化供能不足。哺乳动物卵子质量随年龄增长而下降，部分归因于游离脂肪酸及与β氧化有关的酶水平的降低[16]。

高龄女性卵子体外培养过程中补充左旋肉碱可提高卵子发育潜能，特别是提高优质胚胎率和囊胚形成率，增加健康新生儿出生数量。这是因为左旋肉碱可增加线粒体转录因子a和核呼吸因子1基因的表达，减少线粒体分布异常的卵子数，增加富含线粒体DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）的卵子数，增加超氧化物歧化酶2（superoxide dismutase 2，SOD2）的表达，促进游离脂肪酸β氧化，保护卵子免受游离脂肪酸的毒性，从而提高获卵数和囊胚形成率[15,17]。

2.2 胆固醇卵巢中的胆固醇是类固醇激素的合成前体，对卵泡的生长发育有重要影响。卵丘细胞是卵子胆固醇的主要来源。卵子不能从乙酸酯合成胆固醇，也不能通过受体介导选择性地摄取胆固醇，因为高密度脂蛋白（high-density lipoprotein，HDL）受体[如B族Ⅰ型清道夫受体（scavenger receptor class B type 1，SR-B1）]、低密度脂蛋白受体（low-density lipoprotein receptor，LDLR）及胆固醇生物合成途径中的7种转录酶均不在卵子中表达，但在卵丘细胞中高表达[18]。研究发现虽然卵泡液总胆固醇含量与年龄无关[19]，但高龄女性如21-羟基孕烯醇二硫酸酯、孕二醇-3-葡萄糖醛酸等类固醇的生成减少，孕酮、17α-羟基孕酮含量增加，这可能是由于胆固醇代谢增加所致[20]，也可能是由于胆固醇反馈调节系统受胆固醇调节因子结合蛋白、FSH、LDLR及SR-B1等调控[18]。这些因素受胆固醇稳态控制机制监测，如当类固醇激素减少时，FSH增强卵丘细胞LDLR和SRB1的表达，进而增加卵丘细胞对胆固醇的摄取[18]。HDL是卵泡液中胆固醇的主要脂蛋白，因血液-卵泡屏障存在，其他大分子脂蛋白如低密度脂蛋白、极低密度脂蛋白等在卵泡液中几乎不存在[19]。

研究发现，HDL代谢与卵子发育间存在复杂的相互作用。血液HDL水平与胚胎质量呈正相关[21]，但在体外培养中，HDL浓度过高对胚胎质量产生负面影响[22]。蛋白质印迹（Western blotting）法分析显示，高龄女性卵泡液HDL比年轻女性低，且载脂蛋白A1和载脂蛋白CⅡ水平随年龄增长而降低，载脂蛋白E反而升高，这提示高龄女性胆固醇与载脂蛋白的相互作用及分布对生育力有一定影响[23]。总的来说，与年龄相关的胆固醇代谢、调节及分布的改变，可能影响卵子质量，具体机制有待进一步研究。

2.3 磷脂作为生物膜的重要组成部分，磷脂分为甘油磷脂和鞘磷脂，在酶调节、转录、细胞信号转导及转运中不可或缺。对35岁以上和35岁以下女性卵泡液脂质进行质谱分析发现，35岁以上女性的卵泡液一系列鞘磷脂类、甘油磷脂类等水平均发生显著变化，提示鞘糖脂、甘油磷脂和磷脂酰肌醇磷酸可作为前瞻性脂质生物标志物[23]。一项关于小鼠MⅡ卵子的研究显示，高龄小鼠卵子有26种磷脂类下降，如磷脂酰肌醇、磷脂酸、磷脂酰丝氨酸等，而过氧化氢处理过的年轻小鼠卵子有35种磷脂类下降，二者下降的磷脂类重复率很高，提示卵子膜磷脂是衰老过程中氧化应激的靶点，高龄小鼠卵子膜的完整性与其受精和发育潜能密切相关[24]。另一项研究使用超高效液相色谱和高分辨率质谱对年轻（28～34岁）及高龄女性（35～48岁）卵泡液进行代谢组学分析发现，有3种磷脂代谢物下调[LysoPC(16:1)、LysoPC(20:4)、LysoPC(20:3)]和2种磷脂代谢物上调[LysoPC(18:3)、LysoPC (18:1)]，且体外受精结局亦提示获卵率、2PN卵裂率和可移植胚胎率随年龄增长而降低。提示溶血卵磷脂参与卵泡发育和卵子成熟的调节，其复杂的变化与卵泡发育密切相关[23]。

3 蛋白质代谢

正常人卵泡液含有的蛋白质参与细胞进程，如受体介导的内吞作用、补体激活等，涉及的生物学功能包括细胞分化、增殖和凋亡等，与卵泡发育和卵子成熟密不可分。此外，这些蛋白质在高龄女性及年轻女性中表现的差异性为与年龄有关的卵巢功能减退提供了生物学基础[25]。

一项研究发现，年轻女性（20～32岁）与高龄女性（38～42岁）的卵泡液有19种蛋白存在差异，经串联质谱分析发现，高龄组有5种蛋白质（补体C3及C4、血清转铁蛋白、血液结合素、激肽原）表达发生下调。其中，补体的活化可致血管内皮生长因子缺乏，影响卵子成熟。而抗氧化蛋白血清转铁蛋白及血液结合素减少可致ROS过多而影响生育。激肽原促进卵泡和黄体的生理性血管生成，年龄相关的细胞核和细胞质损伤可能是原始卵泡和卵巢间质血管生成不足所致，导致卵子的质量及数量降低[23]。另外，用液相色谱串联质谱对卵丘细胞蛋白质组学进行检测，鉴定出1 423个蛋白，其中110个在高龄女性（40～45岁）和年轻女性（20～33岁）中存在差异，62个蛋白丰度增加，48个蛋白丰度减少，主要涉及脂肪酸代谢、氧化磷酸化和转录后机制。参与脂肪酸代谢的蛋白表达增加，参与氧化磷酸化的蛋白和转录后RNA加工的蛋白表达减少[26]。因此，对卵子微环境蛋白质组学的认识可加深对卵泡发育过程的理解，有利于卵子质量评价，为临床改善年龄相关的生育力减退提供新的干预措施。

氨基酸是构成蛋白质的肽亚基。卵泡液和COC中关键氨基酸缺乏影响许多重要信号分子、受体和酶，进而改变信号、代谢途径及后续的卵子质量。此外，氨基酸在卵子发育过程中获得RNA转录信息，且参与DNA甲基化调节基因的转录，如蛋氨酸通过形成S-腺苷蛋氨酸在DNA甲基化中发挥关键作用[27]。

一项研究在卵泡液中鉴定出4种氨基酸，包括蛋氨酸、肌酸、组氨酸和反式-4-羟脯氨酸，且这4种氨基酸在高龄女性中的表达水平显著高于年轻女性。其中蛋氨酸是同型半胱氨酸和肌酸的前体，同型半胱氨酸氧化产生自由基，对血管内皮有毒性作用，可降低卵子成熟率。组氨酸具有血管生成和抗血管生成的特性，随着年龄增长，可能抗血管生成占优势，进而影响卵巢功能。反式-4-羟脯氨酸对卵巢作用的研究有限。年龄依赖性增加的蛋氨酸、组氨酸和反式-4-羟脯氨酸与卵子数量呈负相关，可能是卵巢功能随年龄增长而下降的原因[20,28]。相反，有些氨基酸随年龄增长而下降，如D-天冬氨酸、L-苯丙氨酸、脯氨酸。D-天冬氨酸可以诱导激素的生物合成和释放，D-天冬氨酸水平越高，MⅡ卵子形态越好[23]。L-苯丙氨酸通过苯丙氨酸羟化酶参与神经递质合成，其不足可影响下丘脑-垂体功能，对卵子发育不利[1]。脯氨酸保护膜和酶，清除自由基，作为钾离子调节剂和抗氧化剂调节细胞质渗透平衡，参与卵子的有丝分裂和减数分裂过程[1]。

4 结语和展望

高龄女性生育力下降的原因非常复杂，涉及到基因、转录、蛋白以及代谢物等各个层面。卵子与局部微环境双向对话，涉及葡萄糖、脂质、氨基酸等，对卵子发育成熟、受精及后续胚胎发育具有重要作用。由于代谢物与卵子及胚胎发育潜能之间的确定关联及具体机制尚不明晰，未来还需进一步从卵子局部微环境代谢物改变的角度探讨年龄相关性生育力下降的可能因素，以期揭示年龄相关性卵巢功能减退的内在机制，为改善高龄女性助孕生育结局提供方法。