基于转化生长因子β/Smad信号通路探讨中医药干预上皮-间质转化的研究进展

李凯欣，刘朴霖，阎小燕

肺纤维化是一种以成纤维细胞增殖、活化，肌成纤维生成，肺纤维灶不断聚集和大量细胞外基质沉积，并伴有炎症损伤、组织结构破坏等特征的肺部疾病，最终导致纤维瘢痕增生、蜂窝囊形成、肺功能丧失［1］。成纤维细胞、肌成纤维细胞的聚集、活化在肺纤维化过程中发挥了重要作用，目前认为上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是成纤维细胞、肌成纤维细胞的主要来源，且其已被证明在肺纤维化过程中发挥了重要作用［2-3］。吡非尼酮和尼达尼布是目前仅有的两种美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）批准的抗纤维化药物，但其价格昂贵，给肺纤维化患者带来了巨大的经济压力。中医药已被证明可对肺纤维化发挥治疗作用［4］。本文旨在基于转化生长因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）/Smad信号通路探讨中医药干预EMT的研究。

1 EMT概述

EMT是一个完全分化的上皮细胞转变为间充质表型从而产生成纤维细胞和肌成纤维细胞的过程，其与上皮损伤后修复和肺纤维瘢痕形成密切相关。EMT过程中上皮细胞标志物如E-钙黏蛋白、α-连环蛋白降低，间质细胞标志物如N-钙黏蛋白、α-平滑肌肌动蛋白（alpha-smooth muscle actin，α-SMA）、波形蛋白升高，进而降低了细胞间的黏合能力并增加其流动性［5］。有研究者通过对博来霉素诱导的肺纤维化小鼠的肺上皮细胞观察发现，肺纤维化小鼠的肺上皮细胞标志物降低，间质细胞标志物升高［6］。CÂMARA等［7］通过对TGF-β诱导的人肺泡上皮细胞、气道上皮细胞进行观察，发现E-钙黏蛋白降低，α-SMA、N-钙黏蛋白升高。由此可以证明在人和小鼠肺纤维化形成过程中均发生了EMT。EMT是肺纤维化的关键环节，而通过靶向控制EMT有助于延缓肺纤维化的进程。

目前认为EMT主要可以分为三型，1型EMT与胚胎发育过程相关，2型EMT参与组织修复再生和器官纤维化，3型EMT参与肿瘤的转移扩散。其中2型EMT由持续的损伤和炎症引起，是器官纤维化的一个重要过程［8］。大量的信号分子、多肽、信号通路可参与调控EMT进程，如TGF-β、内皮素1或血管内皮生长因子、Notch信号通路、TGF-β信号通路等［9-10］。除此之外，EMT过程中成纤维细胞、肌成纤维细胞产生的细胞外基质也可以促进肺泡上皮细胞的凋亡，影响EMT过程［11］。

2 TGF-β/Smad信号通路概述

TGF-β/Smad信号通路是一种依赖Smad信号途径，并通过生长因子介导的一系列信号传递，对细胞增殖、分化、凋亡、胚胎发育等有着重要的调节作用。TGF-β/Smad信号通路主要由以下几个部分构成。

2.1 TGF-β超家族 目前所知TGF-β超家族成员共包括33个蛋白，即TGF-β、骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）、生长分化因子（growth and differentiation factor，GDF）、活化素、抑制素、抗缪勒管激素（anti-Müllerian hormone，AMH）、Nodal等。根据其分子结构、转导分子的差异可以将BMP、GDF和AMH等组成BMP亚家族，其生物学效应为诱导细胞凋亡、骨与软骨的形成等。TGF-β、活化素和Nodal组成一个亚家族，其生物学效应为抑制有丝分裂，诱导细胞外基质的合成等［12］。

2.2 TGF-β受体 TGF-β受体广泛分布于组织细胞中，目前已知的TGF-β受体可以分为Ⅰ型（TβR-Ⅰ）、Ⅱ型（TβR-Ⅱ）、Ⅲ型（TβR-Ⅲ）。其中TβR-Ⅰ和TβR-Ⅱ参与信号转导，TβR-Ⅲ不直接参与信号转导。TβR-Ⅰ、TβR-Ⅱ的结构均为单次跨膜的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶受体。TβR-Ⅰ在细胞膜与激酶N端存在一个高度保守的GS区域，可以被TβR-Ⅱ磷酸化，而TβR-Ⅱ胞内羟基端有富含丝氨酸/苏氨酸的残基短尾，可以与TGF-β直接结合［13］。

2.3 Smad蛋白 Smad蛋白是TGF-β受体作用的直接底物，根据在TGF-β信号转导中的功能差异，Smad蛋白被分为受体调控的Smad蛋白（receptor-regulated Smad，R-Smad）（包括Smad1、Smad2、Smad3、Smad5、Smad8，其可以与其他Smad蛋白、DNA结合蛋白协同，具有转录活化作用）、通用Smad蛋白（common Smad，Co-Smad）（包括Smad4，其主要作用为协助R-Smad向核转移，保持其转录活性）、抑制Smad蛋白（inhibitory Smad，I-Smad）（包括Smad6、Smad7，其可以拮抗R-Smad与TβR-Ⅰ的结合）［14］。

2.4 转录因子 EMT过程中涉及的转录因子包括SNAIL、TWIST、ZEB等［15］。SNAIL可以直接与E-钙黏蛋白启动子区的E-box结合而抑制其表达，从而破坏细胞间黏附，促进EMT［16］。TWIST属于基本螺旋-环-螺旋转录因子家族，其除了通过与E-钙黏蛋白启动子区的E-box扭曲结合而调控EMT，还可以通过招募组蛋白去乙酰酶而发挥转录因子作用。TWIST过表达可重塑细胞骨架并上调部分重要的信号分子，如Akt2和TGF-β2，以强烈诱导EMT表型［17］。ZEB有与SNAIL类似的作用，除了可以与E-钙黏蛋白启动子区的E-box结合，还可以通过其同源结构区域与PAP1、PCAF等发生蛋白-蛋白交联作用，从而发挥转录作用。三种转录因子相互控制，相互影响，如TWIS、SNAIL可以诱导ZEB的表达，ZEB的表达又常伴随着SNAIL的激活［18］。

3 TGF-β/Smad信号通路与EMT

新合成的TGF-β与潜活性相关蛋白（latencyassociated protein，LAP）以非共价键的形式连接，形成没有活性的休眠复合体。在各种因素刺激下，TGF-β脱去LAP而活化，与靶细胞膜TβR-Ⅱ结合，使TβR-Ⅱ发生自磷酸化，激活TβR-Ⅰ的GS区，活化的TβR-Ⅰ可以激活下游的R-Smad，而R-Smad与Co-Smad结合可形成异源三聚体，进而移入细胞核内。SMAD复合物与转录因子一起介导靶基因的抑制与激活。除此之外，各种转录因子可以通过相互作用而进一步促进EMT，TGF-β可以通过SMAD3介导的转录而诱导SNAIL1的表达，SNAIL1可以通过诱导心肌蛋白转录因子而进一步诱导SNAIL2的表达。SMAD3-SMAD4复合物也可以增加TWIST的活性，并且与ZEB1、ZEB2相互作用而调控EMT［16，19］。

4 中医药对TGF-β/Smad信号通路的调控作用

4.1 单药干预TGF-β/Smad信号通路抑制EMT

4.1.1 清热类中药 皮娜等［20］通过博来霉素诱导肺纤维化小鼠模型发现，经滇龙胆草干预的肺纤维化小鼠血清TGF-β1、Smad2、Smad3表达降低，肺纤维化程度减轻，间质细胞标志物α-SMA降低，上皮细胞标志物E-钙黏蛋白升高，表明滇龙胆草可以通过干预TGF-β1/Smad2/Smad3信号通路来抑制EMT进程。野黄芩苷是一种从半枝莲和黄芩等分离出来的黄酮类化合物。聂娟［21］研究发现，野黄芩苷可以通过抑制TGF-β1的表达，影响其介导的TGF-β1/Smad2/Smad3信号通路，干预EMT，进而减轻博来霉素的肺毒性；同时可激活血管内皮生长因子A/PI3K/AKT信号通路，抑制肺组织中的EMT和异常血管新生。丁大力［22］共筛选出19个知母的有效成分，通过细胞实验、动物实验发现，知母皂苷BⅡ可以通过干预炎性反应、氧化应激、EMT而缓解肺纤维化进程，可以降低大鼠肺组织中TGF-β1、Smad2、Smad3的表达，并提高超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）的含量。SHEN等［23］发现，知母通过干预TGF-β1/Smad信号通路，以剂量依赖性方式保护大鼠免于纤维化，知母减轻了博来霉素导致的肺组织病理学损伤，大鼠肺组织中氮氧化物水平和MPO含量降低，并通过减轻脂质过氧化和增强酶抗氧化活性来调节肺组织中的氧化还原平衡。大黄素是大黄的提取物，研究表明，大黄素可减少胶原蛋白过度生成，减轻炎性细胞浸润、促炎细胞因子和博来霉素引起的肺损伤，抑制并扭转肺上皮细胞的EMT。大黄素可降低TGF-β1的表达和下游信号因子p-Smad2和p-Smad3的表达，并抑制p-IKBa和核因子κB（nuclear factor κB，NF-κB）的积累，进而影响受损肺部Nrf2抗氧化信号的传导过程［24］。

4.1.2 益气养阴类中药 CHANG等［25］使用白术干预TGF-β诱导的肺泡上皮细胞，发现白术可以通过多种途径抑制EMT进程，可以降低TGF-β诱导肺纤维化的作用，并可以抑制Smad2和Smad3的磷酸化，进而抑制EMT；另外，白术也可能抑制Smad非依赖性途径中SNAIL和SLUG的表达。黄莺等［26］将大鼠随机分为博来霉素组、博来霉素+冬虫夏草组、博来霉素+冬虫夏草+Smad3 siRNA组，观测小鼠肺组织中上皮细胞标志物E-钙黏蛋白、间质细胞标志物α-SMA以及信号通路相关分子Smad3、TGF-β1、结缔组织生长因子（connective tissue growth factor，CTGF）的表达，结果显示，博来霉素组小鼠肺泡炎症、肺纤维化程度最重，博来霉素+冬虫夏草组最轻，博来霉素组小鼠α-SMA、Smad3水平最高，博来霉素+冬虫夏草+Smad3 siRNA组α-SMA、CTGF水平较博来霉素+冬虫夏草组升高。认为冬虫夏草可以通过抑制Smad3表达，进而干预EMT。黄芪注射液是从黄芪中提取的天然脂溶性药物，肖雪［27］研究发现，当黄芪注射液浓度超过300 mg/ml时，会导致肺成纤维细胞皱缩甚至死亡；但在适宜浓度下，黄芪注射液可以抑制肺成纤维细胞转化为肌成纤维细胞；TGF-β1诱导的肺成纤维细胞中p-Smad、磷酸化细胞外信号调节激酶1/2（p-extracellular regulated kinases 1/2，p-ERK1/2）、表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）mRNA、Ⅰ型胶原mRNA、ASMA表达较黄芪注射液干预的成纤维细胞升高；单纯DMEM培养基培养的肺成纤维细胞上述指标表达降低。提示黄芪注射液可以通过抑制TGF-β1/Smad3信号通路及EGFR/ERK1/2信号通路而逆转肺纤维化的进程。

WU等［28］结合网络药理学研究和动物实验探索大鼠血浆中五味子的吸收活性成分，首次报道了五味子A可通过TGF-β信号通路抑制肺纤维化。ZHANG等［29］通过单次气管内滴注含有博来霉素的盐水诱导肺纤维化大鼠模型，发现红景天可以减轻大鼠体质量，提高血清谷胱甘肽（glutathione，GSH）和SOD水平，降低肺组织中羟脯氨酸（hydroxyproline，HYP）含量，并降低支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）中肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、TGF-β1、IL-6水平，且肺组织中基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）-9和α-SMA表达水平呈剂量依赖性降低，TGF-β1和MMP-1表达水平也降低，提示红景天具有抗炎、抗氧化、抗纤维化的作用。

4.2 复方制剂通过干预TGF-β/Smad信号通路抑制EMT

4.2.1 益气活血通络类中药 温肺补气通络方是长春中医药大学的自制方剂，包括黄芩、黄芪、当归等13种中药成分，以益气活血通络类中药为组方基础。DING等［30］研究发现，温肺补气通络方可以通过干预TGF-β/Smad3信号通路而抑制EMT，促进细胞外基质降解，进而阻断肺纤维化的进展；此外，其还可抑制TGF-β和Smad3磷酸化水平，减轻博莱霉素诱导的小鼠模型和TGF-β1诱导的细胞模型中EMT和细胞外基质的积累。复明汤可以拮抗TGF-β1/Smad3信号通路传导，抑制TGF-β1诱导的肺泡上皮细胞损伤，而且可以降低TGF-β1诱导的成纤维细胞分化、细胞外基质生成和成纤维细胞迁移［31］。当归、川芎配伍也可以抑制TGF-β1/Smad信号通路，降低炎性因子及HYP水平，并且在二者比例为1∶2时效果最佳［32］。

李晓明等［33］研究发现，补阳还五汤可以降低肺纤维化大鼠TGF-β及p-Smad3水平，抑制TGF-β1/Smad3信号通路，干预肺纤维化进程。加味补阳还五汤是在补阳还五汤的基础上加用淫羊藿、仙茅。研究发现，加味补阳还五汤可以下调Smad3、Wnt3、GSK3β、β-catenin的表达，通过抑制TGF-β/Smads、Wnt/β-catenin信号通路而抗纤维化，缓解EMT进程，减少细胞外基质沉积，抑制肺部血管再生与肺组织的重构［34］。大黄蛰虫丸可以通过抑制TGF-β1/Smad3信号通路及减少细胞外基质沉积而抑制肺纤维化的进展，小剂量的大黄蛰虫丸效果最佳［35］。芪归方由黄芪、当归组成，组方以益气活血为原则。彭艳芳［36］研究发现，芪归方可以改善肺纤维化患者肺功能，治疗后患者中医证候积分、6 min步行距离、生活质量评分、动脉血气分析结果较治疗前好转。动物实验发现，芪归方可以抑制CTGF、TGF-β1、NF-κB等炎性因子表达，降低p-Smad2、p-Smad3水平，提高Smad7水平，抑制miR-21的表达，上调miR-29b、miR-326的表达；且其治疗肺纤维化的效果优于以清热滋阴类中药为组方基础的麦门冬汤［37-38］。

4.2.2 益气养阴类中药 芪麦肺络平汤是中国国家医疗计划为COVID-19恢复期患者推荐的中药方剂，肺纤维化是其适应证之一。临床观察发现，芪麦肺络平汤可改善COVID-19恢复期患者的临床症状和肺功能，降低肺纤维化程度。利用TGF-β1诱导的A549细胞验证和探索芪麦肺络汤的药理作用发现，其可以通过抑制TGF-β而抑制TGF-β1诱导的A549细胞增殖，减弱EMT，促进细胞外基质降解［39］。臧明月等［40］研究发现，麦门冬汤可以降低大鼠肺泡腔内的炎性物质与嗜酸性物质，抑制Smad3的表达，上调Smad7的表达。王酩［41］的研究也证实了这一结果。

4.2.3 清热解毒类中药 新加宣白承气汤是由石膏、大黄、苦杏仁、天花粉、桃仁和土鳖虫六味中药组成的中药配方。QIN等［42］通过动物实验发现，新加宣白承气汤可以通过抑制TGF-β1信号通路中的Smad2磷酸化来抑制大鼠肺部炎症，降低肺部IL-17A、IL-25等炎性因子的表达；通过测定HYP的含量发现，新加宣白承气汤治疗组大鼠肺部胶原含量有所减少，纤维化有所减轻。济南大学自制中药化纤方主要由金荞麦、侧柏叶、猫爪草、地榆、黄芪等药物组成，研究发现，其可以抑制TGF-β1、Smad2/Smad3、p-Smad2/Smad3、TNF-α、IL-1β的表达，降低大鼠肺组织中波形蛋白水平，提高E-钙黏蛋白的表达，推测化纤方通过抑制TGF-β1/Smad信号通路而治疗肺纤维化，且化纤方剂量在1 000 mg/kg时效果最佳［43］。

5 小结

肺纤维化发病机制复杂，包括肺上皮损伤、氧化应激、炎性反应、EMT、内皮-间质转换、细胞凋亡等机制。随着研究的深入，中医药抗纤维化的作用受到广泛重视。本研究总结中医药基于TGF-β/Smad信号通路干预EMT而缓解肺纤维化的研究进展，中医药的种类主要集中在清热、益气养阴、益气活血通络、清热解毒等。但中药组方复杂，无法精准定位药物作用靶点，且药物使用剂量无法精准控制，药动学不清楚。中医药抗纤维化的机制阐释与临床应用尚需深入研究，以期实现精准用药。

作者贡献：李凯欣、阎小燕进行文章的构思与设计、论文的修订；李凯欣、刘朴霖进行研究的实施与可行性分析，文献收集、整理；李凯欣撰写论文；阎小燕负责文章的质量控制及审校，对文章整体负责、监督管理。

本文无利益冲突。