自噬在丙泊酚保护糖尿病大鼠肾缺血再灌注损伤中的作用

胡凤艳,方爱莉,贺建东,王志豪(山西白求恩医院,山西医学科学院,同济山西医院,山西医科大学第三医院麻醉科,太原 030032;通讯作者,E-mail:17876811187@qq.com)

肾缺血再灌注损伤(ischemia/reperfusion injury,IRI)是指已经缺血的肾脏在部分或完全恢复血流后出现的损伤加重和肾功能的恶化。麻醉医师在临床工作中经常遇到的术中低血压、体外停循环、肾移植等都涉及到肾IRI的问题[1],而肾IRI也是围术期急性肾损伤最常见的病因,成为影响患者预后的重要因素[2]。由糖尿病(diabetes mellitus,DM)代谢紊乱引起的DM肾病是终末期肾功能衰竭的原因之一[3],且DM患者对肾IRI的易感性增加,较正常人有更高的病死率和不良预后[4,5]。自噬作为机体的一种防御性机制,自噬激活后能减轻各种应激状态下的细胞损伤,维持器官正常功能,自噬过多则会损伤细胞,导致器官功能的紊乱[6]。微管相关蛋白轻链3(LC3)是用于研究自噬的标志蛋白之一,包括Ⅰ型和Ⅱ型两种,由于Ⅱ型的表达与自噬程度呈正相关,本实验选用LC3-Ⅱ指标。已有研究发现,DM大鼠肾小管上皮细胞存在过度的自噬[7],是引起肾损伤加重的重要原因。而丙泊酚作为一种广泛应用的全身静脉麻醉药,具有高度的脂溶性和抗氧化特性,其被证明可通过抑制自噬减轻DM大鼠心肌IRI[8],也可通过抑制自噬保护缺血性损伤的神经细胞[9],但丙泊酚对DM大鼠肾脏IRI的影响是否也与自噬有关目前尚未知,本研究拟探讨丙泊酚对DM大鼠肾IRI的影响及其机制。

1 材料与方法

1.1 动物及分组

健康清洁雄性SD大鼠,体质量约200～230 g,2～3月龄,由山西医科大学实验动物中心提供,适应性饲养1周以后,采用随机数字表法,将其分为4组(n=15):假手术组(sham组)、DM假手术组(DM+sham组)、DM肾缺血再灌注组(DI/R组)、DM肾缺血再灌注+丙泊酚组(DI/R+P组)。

1.2 DM大鼠模型建立

参照文献[10]的方法构建DM大鼠模型。大鼠禁食10 h后腹腔注射1%链脲佐菌素(批号:S0130,Sigma,美国)50 mg/kg,普通动物饲料喂养72 h后尾静脉采血测量空腹血糖,空腹血糖≥16.7 mmol/L,并出现多饮、多尿、多食和体质量减轻,提示建模成功,期间不进行胰岛素干预,观察其行为表现,定时测量血糖。

1.3 大鼠肾缺血再灌注模型的建立

参照文献[11]的方法建立大鼠肾缺血再灌注模型,术前禁食12 h后,腹腔注射10%水合氯醛溶液3.5 ml/kg麻醉,连接BL-410生物机能实验系统监测心电图,经颈正中切开暴露气管,T形切口气管插管后连接ALC-V8动物呼吸机机械通气(潮气量20 ml/kg,通气频率60次/min,吸呼比1 ∶2),用24号套管针行股动/静脉穿刺置管。采用腹部正中切口,小心游离双侧肾蒂,无创动脉夹夹闭双侧肾动脉,观察肾脏颜色由鲜红色变为暗紫色,60 min后打开动脉夹再灌注24 h,然后迅速关闭腹腔。sham组与DM+sham组仅开腹不夹闭。DI/R+P组于再灌注5 min前经股静脉持续输入丙泊酚[50 mg/(kg·h)]0.5 mg/ml,持续120 min。

1.4 肾功能指标测定

再灌注24 h后,经股动脉采血获取血标本,测定血肌酐(Scr)和尿素氮(BUN)水平,离心(4 ℃,3 000 r/min,10 min),采用山西白求恩医院检验科全自动生化分析仪(日立公司,日本)检测。

1.5 HE染色观察病理切片

随机抽取各组部分肾组织,制备石蜡切片,后进行脱蜡、梯度浓度酒精脱苯,蒸馏水冲洗后苏木素染核15 min,0.5%盐酸酒精分色,伊红复染1 min,100%酒精脱水2次,二甲苯透明3次,制成中性树脂封片,于400倍光学显微镜下观察肾组织HE染色病理学结果。

1.6 Western blot法测定LC3-Ⅱ蛋白表达水平

取肾脏组织,采用Western blot法测定LC3-Ⅱ蛋白表达水平。按照蛋白提取试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)说明,组织打碎后加入细胞裂解液,匀浆离心取上清液,BCA法测定蛋白浓度。80 V电压凝胶电泳90 min,转膜后TBS漂洗,5%的脱脂牛奶室温下摇床封闭1 h,之后加入兔抗鼠LC3-Ⅱ抗体(Proteintech,18725-1-AP),4 ℃孵育过夜。加入HRP的山羊抗兔二抗(1 ∶2 000,武汉博士德生物工程有限公司)。取适量ECL试剂盒(BIO-RAD,1705060)中等体积A液和B液混合,加到目的条带附近避光反应5 min,化学光敏模式曝光显影。以β-actin为内参,以LC3-Ⅱ条带灰度值与β-actin条带灰度值之比反映LC3-Ⅱ的表达水平。

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 制备模型过程中大鼠生存率

在构建糖尿病大鼠模型过程中,2只大鼠在腹腔注射腹腔注射1%链脲佐菌素后2 h内死亡(死亡率4.4%)。在构建大鼠缺血再灌注模型过程中3只大鼠在再灌注5 h内死亡(死亡率6.7%)。死亡大鼠均以同期同步饲养的普通或糖尿病大鼠替代。

2.2 组织形态学观察结果比较

光镜结果显示:sham组肾组织结构基本正常;DM+sham组肾小管、肾间质轻度肿胀,可见少量炎细胞浸润;DI/R组大量肾小管变性、坏死,细胞脱落,管腔变窄,肾间质充血水肿,炎细胞浸润;经丙泊酚输注处理后,DI/R+P组大鼠肾脏组织炎症浸润和充血现象得到缓解,细胞轮廓变得清晰(见图1)。

图1 HE染色检测大鼠肾脏组织Figure 1 Pathological changes of renal tissue by HE staining

2.3 血清Scr、BUN水平和肾脏组织LC3-Ⅱ蛋白表达水平的比较

与sham组比较,DI/R组和DI/R+P组大鼠血清Scr、BUN水平升高,差异有统计学意义(P<0.05),肾脏组织LC3-Ⅱ蛋白表达水平升高(P<0.05);DM+sham组与sham组比较肾脏组织LC3-Ⅱ蛋白表达水平升高(P<0.05),而两组大鼠血清Scr和BUN水平差异无统计学意义(P>0.05)。与DM+sham组比较,DI/R组和DI/R+P组大鼠血清Scr、BUN水平升高(P<0.05),肾脏组织LC3-Ⅱ蛋白表达水平升高(P<0.05);与DI/R组比较,DI/R+P组大鼠血清Scr、BUN水平降低,LC3-Ⅱ蛋白表达水平降低(P<0.05,见表1和图2)。

表1 各组大鼠血清Scr、BUN和肾脏组织LC3-Ⅱ表达水平的比较

图2 Westernblot检测大鼠肾脏组织中LC3-Ⅱ的表达Figure 2 Expression of LC3-Ⅱ in renal tissue of rats by Western blot

3 讨论

肾脏是微循环极为丰富的器官,且具有较大的能量需求,对IRI极为敏感,而DM可加重肾脏IRI[4]。本研究结果表明,DI/R组和DI/R+P组较sham组血清Scr和BUN水平升高,病理性损伤加重,说明缺血再灌注对大鼠肾脏造成了一定程度的损伤。既往研究表明,静脉麻醉药丙泊酚对正常大鼠肾脏IRI具有保护作用[11],在DM大鼠中是否也有相同保护作用尚未得到证实。本研究观察了其对DM大鼠肾脏IRI的作用,研究结果发现,DI/R+P组经过丙泊酚输注处理后血清Scr和BUN水平较DI/R组降低,肾脏病理学损伤减轻,说明丙泊酚可减轻DM大鼠肾IRI。

自噬作为生物体内普遍存在的一种防御性机制,生理条件下,自噬的顺利进行有利于维持细胞内外环境的稳态,进而保障人体各项生命活动的顺利进行。但细胞遭到强刺激时可引起自噬过度,从而使组织细胞损伤加重,甚至引起细胞死亡[6]。研究发现,DM患者体内存在胰岛素抵抗和胰岛素分泌不足,可能会导致对自噬的抑制作用减弱,且DM及其并发症的发生发展与其体内存在的过度自噬有关[12],我们的实验结果也证实了这一点。本研究测定了反映自噬水平的微管相关蛋白轻链3-Ⅱ(LC3-Ⅱ)的水平,研究结果表明,DM+sham组相比sham组LC3-Ⅱ蛋白表达增高,但两组的血清Scr和BUN水平却无差异,因两组均为假手术组,DM病程短,其导致的肾脏损害远较缺血再灌注引起的对肾的损伤轻微。而缺血再灌注的过程同样会导致自噬的增强从而发生细胞损伤[13]。本研究结果表明,DI/R+P组和DI/R组LC3-Ⅱ蛋白表达较两个假手术组均上调,证明了自噬在参与糖尿病肾IRI中的重要作用。

丙泊酚因其具有起效快、半衰期短、不良反应少等优点而被广泛应用于临床麻醉。且丙泊酚具有与抗氧化剂丁化羟基甲苯以及内源性抗氧化剂α-生育酚相似的化学结构,其被证实对人体和大鼠器官具有明显的保护作用[14,15],丙泊酚在细胞自噬的发生中也具有重要的调控作用[16]。本研究研究结果表明,DI/R+P组较DI/R组LC3-Ⅱ蛋白表达水平下调,推测丙泊酚可能通过降低DM肾缺血再灌注时LC3-Ⅱ蛋白的表达水平,而发挥其对DM大鼠的肾保护作用。这也表明丙泊酚可以用于临床麻醉中预防糖尿病患者肾脏IRI。然而,肾IRI的机制是复杂的。有研究认为炎症、细胞内MAPK通路、激活KATP通道等信号通路也参与了肾IRI[17],丙泊酚是否可以直接或间接地影响这些途径尚有待研究。

综上所述,丙泊酚可减轻DM大鼠肾IRI,其机制可能与丙泊酚抑制DM机体细胞内过度自噬有关。