基于网络药理学研究蒙药棘豆止咳散主治“痰、咳、喘”作用机制

苏都那布其，吴凤娇，杨立国，王秀兰*

(1.内蒙古民族大学 蒙医药学院，内蒙古 通辽 028000；2.内蒙古蒙医药 工程技术研究院，内蒙古 通辽 028000)

蒙医药是蒙古族在长期的生产实践中同疾病抗争的经验积累和总结，是我国民族医药之一；其以三根学说、七素学说、寒热理论、脏腑理论、六基病症理论为基础，形成独特理论体系[1]。蒙药具有多成分、多靶点、调节方式多样的特点，蕴含着极大的信息量，因此对治疗复杂疾病上具有明显的特色和优势。棘豆止咳散为内蒙古通辽市库伦旗蒙医医院医院制剂[2]，由甘草、川贝母、多叶棘豆和石膏等4味药组成，用于调节三根平衡，清除希拉热邪，从而达到清热、润肺、化痰、止咳和平喘作用。现代研究表明多叶棘豆主要活性成分为黄酮类成分[3]，甘草主要活性成分为三萜皂苷类成分[4]和黄酮苷类成分[5]，具有镇咳、抗炎、调节免疫等药理作用[6]；川贝母主要活性成分为甾体生物碱[7]，石膏主含含水硫酸钙[8]。查阅相关文献发现棘豆止咳散为民间经验积累，少数研究集中在质量控制[9-11]上，缺少科学药效实验研究。故本研究先运用动物实验观察棘豆止咳散对小鼠的止咳、化痰和平喘作用，后基于网络药理学研究方法，以棘豆止咳散主要活性成分为研究对象，通过建立“棘豆止咳散活性成分-靶点-通路”网络，阐述其止咳、化痰和平喘作用机制。

1 棘豆止咳散止咳、化痰和平喘药效学研究

1.1 材料

1.1.1 实验动物与药物 SPF级昆明级小鼠，体质量(20±2)g，雌雄各半(购自辽宁长生生物有限公司，动物许可证号：SCXK(辽)-2015-0001)；棘豆止咳散(高、中、低)由库伦旗蒙医医院提供；肺宁颗粒(批号：190160016；吉林华康药业股份有限公司)；氨茶碱片(批号：190218；山西太原药业有限公司)。

1.1.2 实验仪器与试剂 TG16-WS离心机(上海安亭科学仪器)；UV-1500PC紫外可见分光光度计(上海四科仪器设备有限公司)；AUY120EXP电子分析天平(日本岛津)；YLS-8A多功能诱咳引喘气仪(江苏赛昂斯生物科技有限公司)；HH-W600恒温水浴锅(常州金南仪器制造有限公司)；酚红(天津大茂化学试剂厂，批号：20180915)；氨水(天津大茂化学试剂厂，批号：20190103)；生理盐水(吉林省都邦药业股份有限公司，批号：H19031812)；磷酸组胺(批号：527A021，美谷生物科技(浙江)有限公司Solarbio品牌；纯度≥98.0%)。

1.2 方法

1.2.1 浓氨水致小鼠咳嗽实验[12-14]取SPF级昆明级小鼠50只，体质量(20±2)g，雌雄各半，适应性饲养3 d后按体质量随机分为正常组(给予等量蒸馏水)，棘豆止咳散低、中、高给药组(1.17 g/kg、2.34 g/kg、3.51 g/kg)，阳性对照组为肺宁颗粒(0.072 g/kg)，共5组。各组小鼠分别灌胃给予药物，给药体积为0.2 mL/10 g，每日1次，连续给药7天。末次给药前禁食不禁水12小时后给药，给药1 h后，将小鼠置于YLS-8A多功能诱咳引喘气仪中，氨水喷7 s后按小鼠出现腹肌收缩、缩胸、张大嘴，咳声有无，作为咳嗽反应标准，观察并记录小鼠从接受喷雾开始到出现咳嗽的时间(咳嗽潜伏期)3 min内咳嗽反应总次数。

1.2.2 小鼠气管段酚红排泌实验(祛痰实验)[12-14]按“1.2.1”方法取SPF级昆明级小鼠50只，给药1 h后，每只小鼠腹腔注射0.5%酚红溶液0.5 mL，30 min后脱颈椎处死。动物仰卧固定，解剖分离出气管。于喉头下将磨平头的7号针头插入气管内约0.3 cm，丝线结扎固定，用1 mL注射器吸取0.5 mL 5%碳酸氢钠溶液，反复灌洗呼吸道3次，并将灌洗液回收集中注入干净试管中。按上述方法操作3次，合并3次的洗液，置离心机中离心20 min(12 000 r/min)，取上清液于比色管中，用分光光度计测定 546 nm 处吸光度(A)值，以A值高低代表呼吸道酚红排泌量。

1.2.3 磷酸组胺诱发小鼠哮喘实验(平喘实验)[12-14]按“1.2.1”方法取SPF级昆明级小鼠50，阳性对照组为氨茶碱片(0.082 g/kg)，将小鼠置于YLS-8A多功能诱咳引喘气仪中，喷予5%磷酸组胺溶液30 s，后记录观察小鼠6 min内引喘的潜伏期，即从喷入药液到小鼠第一次抽搐的时间。

1.3 结果

1.3.1 棘豆止咳散对浓氨水致小鼠咳嗽实验的影响 与对照组比较，棘豆止咳散高剂量组咳嗽次数显著减少(P<0.05)；棘豆止咳散中剂量组与高剂量组咳嗽潜伏期显著延长(P<0.05，P<0.01)。见表1。

表1 棘豆止咳散对浓氨水致小鼠咳嗽实验的影响

1.3.2 棘豆止咳散对小鼠气管段酚红排泌实验(祛痰实验)的影响 与对照组比较棘豆止咳散高剂量组吸光度(A)值明显增加(P<0.05)。见表2。

表2 棘豆止咳散对小鼠气管段酚红排泌实验(祛痰实验)的影响

1.3.3 棘豆止咳散对磷酸组胺诱发小鼠哮喘实验(平喘实验)的影响 与对照组比较棘豆止咳散中剂量组引喘潜伏期(S)值明显增加(P<0.05)，高剂量组引喘潜伏期(S)值明显增加(P<0.01)。见表3。

表3 棘豆止咳散对磷酸组胺诱发小鼠哮喘实验(平喘实验)的影响

2 基于网络药理学研究蒙药棘豆止咳散止咳、化痰和平喘作用机制

2.1 方法

2.1.1 棘豆止咳散化学成分收集与活性成分筛选 通过TCMSP数据库对甘草、川贝母化合物进行收集，根据ADME：OB≥30%，DL≥0.18进行筛选，再以活性成分相关文献予以补充；TCMID数据库收集石膏相关信息；多叶棘豆化学成分查询相关文献收集，再以ADME参数筛选。

2.1.2 活性成分靶点预测 TCMSP数据库收集活性成分相关靶点，TCMSP数据库未收集到的活性成分能相关靶点的再利用Pubchem数据库，收集活性成分Canonical SMILES格式，将 SMILES格式文件导入到Swiss Target Predicton数据库，设置属性为“Homo Sapiens”，预测相关靶点，去掉Probability值为0的所有靶点；STITCH数据库收集石膏相关靶点；靶点进行除重。

2.1.3 棘豆止咳散止咳、化痰和平喘作用靶点的收集 将活性成分预测靶点信息与DisGeNET数据库以“Coughing”和“Asthma”为关键词收集止咳平喘相关靶点信息，DrugBank数据库以“Phlegm”为关键词收集化痰相关靶点信息进行比对，作韦恩图进行交集分析，收集棘豆止咳散止咳、化痰和平喘作用靶点。

2.1.4 关键靶点蛋白相关作用(PPI)网络的构建 将棘豆止咳散止咳、化痰和平喘作用靶点导入STRING数据库，选择物种为“Homo Sapiens”进行计算，设定评分分值>0.4，获得蛋白互作关系，保存为tsv格式文件。运用R语言抽取网络中的关键靶点的信息条形图筛选出核心靶点。

2.1.5 GO富集分析和KEGG通路注释分析 为了研究化合物可能作用的生物学通路以及靶点之间的相关关系，揭示靶点蛋白的相互作用关系以及在基因功能上的富集情况，将筛选的棘豆止咳散止咳、化痰和平喘作用靶点导入生物学信息注释数据库(DAVID)进行GO富集分析和基因与基因组百科全书(KEGG)代谢通路注释分析，选择物种为(Human)，得到P<0.05的GO功能富集和KEGG通路。

2.1.6 “活性成分-靶点-通路”网络构建 将棘豆止咳散活性成分、潜在靶点、通路数据导入Cytoscape 3.7.2软件，通过Merge工具构建网络。

2.2 结果

2.2.1 棘豆止咳散活性成分 过TCMSP数据库对甘草、川贝母化合物进行收集，根据ADME：OB≥30%，DL≥0.18进行筛选，在以活性成分相关文献予以补充；TCMID数据库收集石膏相关信息；多叶棘豆化学成分查询相关文献收集，在以ADME参数筛选后得111个活性成分。棘豆止咳散各单味药活性成分及相关信息见表4。

续表4

续表4

2.2.2 潜在靶点 基于TCMSP和Swiss Target Predicton数据库得到1 235个基因靶点，删除重复项后得到472个基因靶点。通过与DisGeNET和DrugBank疾病数据库中止咳、化痰和平喘相关靶点进行比对，最终筛选出46个潜在靶点。见图1与表5。

图1 棘豆止咳散止咳、化痰和平喘作用靶点韦恩图

表5 棘豆止咳散止咳、化痰和平喘作用靶点信息

续表5

2.2.3 蛋白互作(PPI)与核心靶点 登录STRING数据库，上传棘豆止咳散止咳、化痰和平喘潜在靶点，设定置信度评分分值>0.4，将独立于网络之处的蛋白排除，得到棘豆止咳散止咳、化痰和平喘潜在靶点PPI网络图(见图2)。运用R语言抽取网络中的关键靶点的信息条形图(见图3)。结果表明，IL6、PTGS2、TNF、VEGFA等蛋白的度值较高，说明这些蛋白在网络中的作用显著，是和其他蛋白互通的纽带。

图2 关键靶点PPI网络

图3 关键靶点信息

2.2.4 GO功能富集分析 GO注释分析由生物过程(Biological process，BP)、细胞组成(Cellular component，CC)、分子功能(Molecular function，MF)3个部分组成，共同描述基因生物学功能。将棘豆止咳散止咳、化痰和平喘作用靶点上传到DAVID平台，根据PValue<0.05为筛选条件，共收集到530条BP条目主要涉及激素刺激反应(Response to hormone stimulus)、对有机物的反应(Response to organic substance)、对内生刺激的反应(Response to endogenous stimulus)、细胞凋亡的调控(Regulation of apoptosis)等；32条CC条目主要涉及细胞外间隙(Extracellular space)、细胞外区(Extracellular region part)、神经元投射(Neuron projection)、细胞分数(Cell fraction)等；25条MF条目主要涉及细胞因子活性(Cytokine activity)、同一蛋白结合(Identical protein binding)、蛋白质二聚活性(Protein dimerization activity)、蛋白质均聚活性(Protein homodimerization activity)等，根据PValue值，用条形图分别列举了各类被排在靠前的10个条目。见图4。

2.2.5 KEGG通路富集分析 将棘豆止咳散止咳、化痰和平喘作用靶点上传到DAVID平台进行富集分析，根据PValue<0.05为筛选条件，共获得16条KEGG信号通路。信号通路包括细胞因子-细胞因子-受体相互作用(Cytokine-cytokine receptor interaction)、癌症的途径(Pathways in cancer)、钙信号通路(Calcium signaling pathway)、哮喘(Asthma)、肠免疫网络用于IgA的产生(Intestinal immune network for IgA production)等。见图5。

注：A.生物过程(BP)；B.细胞组成(CC)；C.分子功能(MF)。图4 GO功能富集分析

图5 KEGG通路富集分析

2.2.6 棘豆止咳散化合物-靶点-通路网络构建 将棘豆止咳散活性成分、作用靶点、KEGG通路信息导入Cytoscape 3.7.2软件中构建网络，见图6。按Degree值和BC值大小排序筛选核心成分和靶点，结果显示，quercetin、luteolin、apigenin、kaempferol等为核心成分，PTGS2、NOS2、ADRB2、TNF等靶点为核心靶点，从而可以看出棘豆止咳散多成分-多靶点-多通路的作用特点。

3 讨论

石膏主含含水硫酸钙(CaSO4·2H2O)，具有清热泻火、除烦止渴之功效，用于外感热病，高热烦渴，肺热喘咳，胃火亢盛，头痛，牙痛[8]。文献[15]对 2005 版《中国药典》所含石膏制剂进行统计，总计有29个中成药含有石膏，以治疗感冒、咳嗽药为主。其中所含石膏在处方中所占比例一般在3%～45%之间，个别高达90%，由此肯定棘豆止咳散中石膏具有一定的止咳、化痰和平喘作用。但含水硫酸钙记录靶点少，从而本次研究中未能体现石膏的止咳、化痰和平喘作用。

棘豆止咳散为内蒙古通辽市库伦旗蒙医医院医院制剂，由杀“黏”、清热、燥“协日乌素”的蒙古族习用药材多叶棘豆为主药，处方比例为多叶棘豆30 g 、川贝母15 g 、甘草30 g 、石膏15 g，用于“巴达干”“赫依”引起的咳嗽、感冒。本研究采用经典的浓氨水致小鼠咳嗽实验、小鼠气管段酚红排泌实验(祛痰实验)、磷酸组胺诱发小鼠哮喘实验(平喘实验)等药理实验方法研究棘豆止咳散的止咳、祛痰和平喘药效学作用，并选择临床止咳祛痰常用药肺宁颗粒与用于支气管哮喘常用药氨茶碱片为阳性对照组，结果棘豆止咳散止咳、祛痰和平喘作用显著，且化痰作用比阳性对照组显著。

注：四边节点代表蒙药，六边形节点代表活性成分，圆形节点代表作用靶点，长方形节点代表作用通路。图6 棘豆止咳散“蒙药-活性成分-靶点-通路”网络

本研究在棘豆止咳散止咳、祛痰和平喘药效学作用上，采用网络药理学研究方法共筛选出111个活性成分(甘草92个、川贝母15个、多叶棘豆8个、石膏1个)，潜在作用靶点472个，46个与止咳、祛痰和平喘重合靶点。根据“成分-靶点-通路”网络图按Degree值和BC值大小排序前5位化合物为槲皮素、木犀草素、山奈酚、芹菜素、柚皮素。据报道槲皮素具有抗炎、抗病毒和免疫调节等药理作用[16]，木犀草素具有消炎、抗菌、抗病毒、免疫调节等作用，临床主要用于止咳、祛痰和消炎[17-18]，山柰酚具有抗炎、抗菌、抗病毒、增强机体免疫等多种药理作用[19]，芹菜素具有抗肿瘤、心血管保护、抗病毒、抗菌等药理作用[20-22]，柚皮素具有一定增强细胞免疫、抗炎的药理作用[23]，综上棘豆止咳散关键前5种化合物具有抗炎、抗病毒、抗菌、止咳、祛痰和免疫调节能力，故而进一步确定了棘豆止咳散止咳、祛痰和平喘药效学作用，也说明了蒙药棘豆止咳散多成分、多靶点、多途径的特点。