二次杀菌方式对红肠在冷藏过程中微生物及理化性质影响的研究

牛文秀，陈援援，秦建鹏，杜俊杰，柳国鹏，马俪珍,2,*

（1.天津农学院食品科学与生物工程学院，天津 300384；2.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083）

红肠作为典型的低温肉制品，是将修整的肉类原料经低温腌制、绞肉、制馅、灌制、烘烤、蒸煮、烟熏等工序制得。红肠是我国北方的一种传统肉制品，因其味道鲜嫩、口感脆弹、色泽红艳、营养丰富和携带方便等特点深受广大消费者的喜爱，在东北地区“哈尔滨红肠”具有广阔的消费市场。但由于产品含水量较高，营养丰富，在储存和销售中极易发生腐败，因而保质期较短。市面上销售的红肠产品主要为牛皮纸袋普通包装和真空包装两种方式。随着人们生活水平的不断提高，消费者对红肠的风味、感官品质、抗氧化性和安全性等要求也越来越高。如果按照这样的包装和销售方式，产品在储藏过程中由于酶、微生物的作用易导致红肠的腐败变质，不仅降低其营养价值和食用品质，还会带来食品安全问题[1]。姚来斌等[2]研究发现：真空包装的红肠（未经过杀菌处理）在室温贮藏15 d时已经开始腐败变质，假单胞菌和乳酸菌为其主要的优势腐败菌。研究表明，食品真空包装后进行低温杀菌，虽然不能杀死肉制品中的所有细菌，却可以大大降低产品的初始菌数，且杀菌后立即进行降温、冷藏储存，可以达到延长产品货架期的目的[3-6]。有研究报道，真空包装烤通脊经90℃杀菌10 min，其储藏期在25℃和8℃下分别可达12 d和1个月[7]。

为了延长红肠产品的保质期，同时又保持其营养价值和品质，本研究将红肠产品真空包装后进行不同杀菌处理，即：采用沸水煮制杀菌30 min、迅速冷却后为一次杀菌方法；用同样的杀菌方法重复2次，即为二次杀菌方法，两次杀菌处理间隔时间为常温储藏24 h，目的使第1次未杀死的某些芽孢菌萌发出营养体，第2次杀菌时将其杀灭。将两种杀菌处理的红肠与不杀菌处理的对照组进行比较，分析产品在冷藏过程中理化指标和微生物指标的变化，为保持红肠产品营养和品质的前提下，寻求一条延长红肠产品保质期的有效途径。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 材料与试剂

猪4号肉（猪后腿肌肉）、肥膘、鸡胸肉、食盐、白砂糖、葡萄糖、鸡蛋、蒜，购于天津市红旗农贸大型批发市场；肉桂精油、大茴香精油、丁香精油、白胡椒精油，天津市春合科技开发有限公司产品；玉米淀粉、大豆分离蛋白，郑州裕和食品添加剂有限公司产品；人工胶原蛋白肠衣（牛二层皮提取、孔径30 mm），神冠控股（集团）有限公司产品。

氯化钠、三氯甲烷、2-硫代巴比妥酸、亚硝酸钠、亚铁氰化钾、乙酸锌、对氨基苯磺酸、盐酸萘乙二胺、硼酸（均为分析纯）、乙腈、三氯乙酸、盐酸、氢氧化钠、碳酸氢钠，天津市风船化学试剂科技有限公司产品；高氯酸、丙酮、丹磺酰氯（均为分析纯），国药集团化学试剂有限公司产品；营养琼脂、假单孢菌CFC选择性培养基、MRS培养基、结晶紫中性红胆盐葡萄糖琼脂，青岛高科技工业园海博生物科技有限公司产品；配制试剂所用水均为超纯水。

1.1.2 仪器与设备

BVBJ-30F真空搅拌机、BJRJ-82绞肉机、BYXX-50多功能烟熏炉，浙江嘉兴艾博实业有限公司；XZ-5L灌肠机，广州旭众食品机械有限公司；PQ-001低场核磁共振成像仪，上海纽迈电子科技有限公司；PB-10酸度计，德国赛多利斯科学仪器有限公司；SX-500多功能高压蒸汽灭菌锅，日本Tony公司；RE-2000A旋转蒸发仪、LC-CCA冷却液循环泵，上海力辰仪器科技有限公司；CLASSⅡ生物安全柜，天美（中国）科学仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 工艺流程

选料→修整→绞碎（筛板孔10 mm）→腌制→配料→真空拌馅→真空灌装→干燥→蒸煮→烟熏→烘烤→冷却→初检→包装→成品

1.2.2 操作要点

将原料肉10 kg（猪瘦肉4 kg、肥膘2 kg、鸡胸肉4 kg）中的瘦肉绞碎，肥肉用切肉机切成小丁，在绞碎的瘦肉中添加配制好的腌制液（包含食盐、复合磷酸盐、抗坏血酸钠、亚硝酸盐等），搅拌均匀，于4℃冰箱中腌制20 h；然后将腌制好的瘦肉放入真空搅拌机，再加入肥膘丁、玉米淀粉、蒜泥、复合精油、冰水后启动真空搅拌机充分拌匀，然后灌肠；将灌好的肠经温水漂洗、排气后于烟熏炉中熟制，熟制参数为：70℃干燥60 min，85℃蒸煮60 min，85℃烟熏60 min，75℃烘烤60 min；红肠冷却后真空包装。

1.2.2 试验方案设计

将真空包装后的红肠平均分成3份：取1份不进行杀菌处理，作为对照组（CK）；将其余2份同时放入沸水中煮制30 min，流动水快速冷却至室温，取其中一半放入冷库中作为一次杀菌组；另一半放在室温下放置24 h，目的是使一次杀菌后未经杀死的芽孢菌萌发出营养体，再进行一次相同的杀菌处理过程，以达到杀菌的目的，作为二次杀菌组。将3组样品同时置于0～4℃下进行储藏，分别在储藏的0、1、3、5、7、9周取样分析理化指标（pH、TBARs值、亚硝酸盐残留量、水分迁移变化）和微生物指标（细菌总数、肠杆菌科菌、假单胞菌、乳酸菌）。

1.2.3 测定项目与方法

1.2.3.1 微生物指标

菌落总数：参照GB 4789.2—2016[8]的方法测定。

乳酸菌：参照GB 4789.35—2016[9]的方法测定。

肠杆菌科菌：参照GB 4789.41—2016[10]的方法测定。

假单胞菌：参照SN/T 4044—2014[11]的方法测定。

1.2.3.2 理化指标

pH：参照GB 5009.237—2016[12]进行测定。

TBARs值：参照GB 5009.181—2016[13]测定，以每kg红肠样品中含有的丙二醛质量（mg）表示TBARs值。

亚硝酸盐残留量：参照GB 5009.33—2016[14]中的第二法进行测定。

水分迁移变化：按照鲍佳彤等[15]的方法，并稍加修改，采用核磁共振成像仪测定。将2 cm样品放入核磁管底部，置于分析仪中，采用Q-CPMG序列进行测定。测试参数为：质子共振频率（SF）22 MHz，90°脉宽15.00μs，重复采样等待时间4 000 ms，回波时间0.3 ms，回波个数2 000，采样频率200 Hz，累计采样。

1.2.4 数据处理

数据采用Microsoft Excel软件计算平均值与标准差，用Statistix 8.1软件进行显著性分析，Origin 2019b 64Bit软件绘图。

2 结果与分析

2.1 杀菌处理对冷藏过程中红肠微生物数量的影响

菌落总数并非致病菌指标，属于卫生指示菌，主要用来评价食品清洁度；肠杆菌群数的高低反映了食品中粪便污染的程度；假单胞菌是低温肉制品中主要的腐败菌，常常是导致肉制品腐败的优势菌[5]。由表1可知，3组红肠在冷藏过程中的各种微生物数量均处于较低水平，这说明本试验的红肠在加工过程中严格控制了原料肉的初始菌数和品质，加之较低的加工环境温度和严格的卫生条件，同时采用真空包装和冷藏储存，这些综合措施可以有效地控制产品中的微生物数量。随着冷藏时间的延长，3组红肠的菌落总数、乳酸菌、肠杆菌科菌、假单胞菌的变化趋势基本一致，均呈一定程度的增加，但增幅速度有明显差异。CK组冷藏9周时的菌落总数升至80.33 CFU/g，一次杀菌组在冷藏9周时的菌落总数升至62.00 CFU/g，而二次杀菌组冷藏7周时才首次被检出菌落（菌落总数为17.33 CFU/g），9周时仅升至34.00 CFU/g。二次杀菌组的肠杆菌和假单胞菌在冷藏9周时首次检出，且数量显著低于CK和一次杀菌组（P＜0.05），说明二次杀菌可以有效地控制微生物的生长繁殖，延长产品保质期。

2.2 杀菌处理对冷藏过程中红肠pH的影响

由图1可以看出，与CK组相比，经过二次杀菌的红肠在冷藏3周时，pH有明显的下降趋势（P＜0.05）。至冷藏5周后，3组红肠的pH开始缓慢升高，经9周冷藏，CK组、一次杀菌组和二次杀菌组的pH分别升至6.71、6.69、6.68，均小于7.0。pH的升高是由于微生物作用于肌肉蛋白质分解产生碱性氨基酸和其他碱性物质而导致的。由于本试验加工的3组红肠的微生物数量控制在很低的水平（见表1），所以冷藏末期产品的pH仍保持在较低水平。

图1 杀菌处理对冷藏过程中红肠pH的影响Fig.1 Effects of sterilization treatments on pH values of red sausages during cold storage

表1 杀菌处理对红肠在冷藏过程中微生物指标的影响Table 1 Effects of sterilization treatments on the microorganisms indexes in red sausages during cold storage 单位：CFU/g

2.3 杀菌处理对冷藏过程中红肠TBARs值的影响

TBARs值是衡量肉制品脂肪氧化程度的重要指标之一，当TBARs值＞0.5 mg/kg时，肉制品加热后会出现热异味；当TBARs值＞1.0 mg/kg时即为变质肉[16]。由图2可知，在9周的冷藏过程中，3组红肠的TBARs值均呈不同程度的升高趋势。3组之间进行比较发现，CK组在冷藏的0、5、7、9周均显著高于一次和二次杀菌组（P＜0.05），整体上TBARs值大小为CK组＞一次杀菌组＞二次杀菌组。冷藏9周时，CK组TBARs值陡然升高至0.46 mg/kg，而其他2组仍然缓慢上升，二次杀菌组的TBARs值仅为0.34 mg/kg，比CK组降低了26.1%。试验结果表明，进行二次杀菌可以显著抑制红肠中脂肪的氧化，这是因为经过杀菌处理尤其是二次杀菌，可以显著抑制微生物的生长繁殖，由于某些微生物可能导致脂肪和蛋白质的氧化，所以控制微生物的生长繁殖亦可以适当控制肉制品的脂肪氧化。康怀彬等[17]研究表明对烧鸡采用85～90℃、30 min的二次杀菌方式可以有效控制脂肪氧化的发生。

图2 杀菌处理对冷藏过程中红肠TBARs值的影响Fig.2 Effects of sterilization treatments on TBARs values of red sausages during cold storage

2.4 杀菌处理对冷藏过程中红肠亚硝酸盐残留量的影响

由图3可以看出，各组红肠在冷藏初期的亚硝酸盐残留量就很低，其中CK组初值最高，为9.4 mg/kg，这是因为本试验加工的红肠在加工中亚硝酸盐添加量较低（0.1 g/kg），远低于国家最大添加量（0.15 g/kg）[18]。从第3周开始，随着冷藏时间的延长，3组红肠的亚硝酸盐残留量呈显著下降趋势（P＜0.05）。亚硝酸盐残留量从高到低的顺序为CK组＞一次杀菌组＞二次杀菌组，且在各个冷藏时间点差异均达显著水平（P＜0.05）。试验结果显示，杀菌处理可以显著降低红肠的亚硝酸盐残留量，这在安全性方面具有独特优势。

图3 杀菌处理对冷藏过程中红肠亚硝酸盐残留量的影响Fig.3 Effects of sterilization treatments on nitrite residue contents in red sausages during cold storage

2.5 杀菌处理对红肠在冷藏过程中水分迁移的影响

一般来说，T2越短表明水与底物结合越紧密，T2越长表明水分越自由。P22表示T22的积分面积占总积分面积的百分比，也代表T2区间氢质子的相对含量。不易流动水的横向弛豫时间T22越短，其峰面积比例P22越大，红肠的空间网络结构结合越紧密，表明凝胶特性就越好[19]。由图4和表2可以看出，3组样品在冷藏期测出的T2波谱图大致有4个峰，T21（0～10 ms）代表与大分子结合紧密的结合水，T22（10～100 ms）代表存在于凝胶空隙中的不易流动水，T23（100～1 000 ms）代表能够自由流动的自由水。分析3组红肠在冷藏开始时的T22值发现：与CK组相比，一次杀菌组的T22没有发生变化，但二次杀菌组的T22却略有增大，其T22值由37.649 ms升高到41.408 ms（见表2）。这提示不易流动水向右发生了迁移，说明经过二次加热杀菌后，红肠中肌原纤维蛋白的网络结构受到一定程度的影响，对水分约束力略有减弱。随着冷藏时间的延长，3组红肠的T22整体呈下降趋势，说明在冷藏过程中，红肠中水分和蛋白质大分子之间的结合力逐渐增强，水分流动性降低，部分自由水转化为结合水。但经冷藏9周后，3组红肠内部分不易流动水又转化为自由水，预示着红肠的品质向劣变方向变化。

图4 冷藏过程中各组红肠横向弛豫时间T2波谱图Fig.4 Transverse relaxation time T2 spectra of red sausages during cold storage

由表2可知：冷藏第5天时，二次杀菌组的P22值显著低于CK组（P＜0.05）；冷藏第9天时，一次杀菌组的P22值显著低于CK组和二次杀菌组（P＜0.05）。随着冷藏时间的延长，CK组的P22值没有发生显著变化，而一次杀菌在冷藏第7天时P22值出现显著降低趋势（P＜0.05），二次杀菌组在第5天时出现显著降低趋势（P＜0.05）。

表2 杀菌处理对红肠在冷藏过程中横向弛豫时间T22和不易流动水含量P22的影响Table 2 Effects of sterilization treatments on transverse relaxation time T22 and immobile water contents P22 of red sausages during cold storage

3 结论

随着红肠冷藏时间的延长，尽管各组微生物数量有缓慢增加趋势，但经过一次和二次杀菌处理后可显著抑制菌落总数、肠杆菌科杆菌、假单胞菌、乳酸菌的生长，二次杀菌组在冷藏9周后的菌落总数、乳酸菌、肠杆菌科杆菌、假单胞菌分别为34.00、18.00、11.00、12.67 CFU/g，远远低于国家标准。随着冷藏时间的延长，3组红肠的TBARs值呈升高趋势，亚硝酸盐残留量呈下降趋势。但3组处理组中TBARs值变化最缓慢的是二次杀菌组，其次是一次杀菌组；亚硝酸盐残留量最低的始终是二次杀菌组。从水分迁移的变化来看，二次杀菌的红肠在刚冷藏时不易流动水的横向驰豫时间T22由CK组的37.649 ms升高至41.408 ms，说明不易流动水向右发生了迁移，对水分约束力略有减小。由此说明，常压杀菌尤其是经过二次杀菌的红肠，其微生物指标、脂肪氧化程度、亚硝酸盐残留量均呈现降低趋势，显著提高了红肠的食用安全性，但对产品中肌肉蛋白的保水性方面有一定的负面影响。