mRNA药物研发的主要关键技术

凡文超，史新昌 综述，周勇 审校

卫生部生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室中国食品药品检定研究院重组药物室，北京 100050

1961年，BRENNER等［1］发现一种存在于DNA 和蛋白质之间传递信息的不稳定中间体——信使RNA（messenger RNA，mRNA），但将其应用于疾病治疗和预防的构想一直未得到验证。直至1989—1990年，分别在真核细胞和小鼠体内递送外源性mRNA［2-3］，并实现了蛋白表达，以mRNA作为基因治疗药物或预防疫苗在医药、临床、应用研究等领域中的巨大的研发潜力才呈现出来。mRNA携带的遗传信息可满足所有功能蛋白以及免疫原蛋白的编码和表达，在应用于基因治疗药物及预防疫苗研究时，相比于其他同类制品，基于mRNA的药物设计具有很多独特的优势，如自佐剂特性使mRNA作为疫苗应用时，不需额外的佐剂即可刺激机体产生强大而持久的免疫反应［4］；体外转录使mRNA的获得成本较低［5］；mRNA不需进入细胞核内，在细胞基质中即可行使功能，避免了因整合宿主基因组导致的突变；在作为治疗性药物应用时，缺乏CpG岛结构使mRNA诱导机体产生排斥反应的可能性也较小［3］；mRNA较短的分子寿命和内源性物质组成也使机体能够容易将其代谢分解而不会给机体造成较大负担［6］。这些独有的优势使mRNA在基因治疗、疫苗领域越发受到关注和研究。

以mRNA治疗或预防疾病，其技术体系具有较高的通用性，尽管免疫原蛋白或治疗蛋白编码基因不同，但mRNA合成、修饰、纯化、递送等技术基本一致，因此，基于mRNA开发出针对多种疾病预防及治疗应用研究的标准化体系成为可能［7］。目前，针对多种疾病治疗及预防的基于mRNA为基础的药物、疫苗已得到广泛研究，自1997年第一家基于mRNA的药物公司成立后，许多实验室陆续开展了mRNA基因治疗药物和疫苗的研究开发。

本文主要介绍了基于mRNA药物设计的主要关键技术，如mRNA体外转录合成（in vitro transcription，IVT）、核苷修饰以及加帽加尾方法的技术原理及研究进展，其次对mRNA纯化方法、递送系统进行了简要介绍，为mRNA基因治疗药物及疫苗开发提供支持。

1 mRNA的合成与修饰

自1989年成功利用脂质体将外源性mRNA递送至细胞内，前后数十年间，关于mRNA的各项技术研究，如体外合成、修饰、递送均得到充足发展。1984年，KRIEG等［8］首次利用SP6 RNA聚合酶和cDNA体外转录mRNA；1990年，金由辛［9］认为，T7 RNA聚合酶更适合于RNA体外大量合成；2005年，KARIKÓ等［10］研究发现，利用修饰核苷合成的RNA具有通过抑制Toll样受体识别从而具备更低的天然免疫原性；之后于2008年发现，利用假鸟苷替代鸟苷的mRNA具备更高的翻译效率、稳定性及更低的免疫原性［11］。其他常用的核苷修饰如5'-甲基胞苷（m5C）、2-硫尿苷（s2U）也已经被证实具有降低mRNA免疫原性的作用［12］。

1.1 mRNA体外合成

应用于疫苗及基因治疗药物的mRNA主要有2种形式，一种是传统的非复制型（non-replicating）mRNA，该型mRNA含有目的基因编码序列以及5'端和3'端非翻译区（untranslated region，UTR）；一种是自扩增型（self-amplifying，SAM）mRNA，该型mRNA在非复制型mRNA的基础上，还含有一段特定的病毒复制基因，使得mRNA在胞内能够大量扩增［13］。2种形式均利用胞内核酸翻译机制以完成mRNA编码治疗性蛋白或免疫原蛋白的表达。以下以传统的非复制型mRNA（利用噬菌体RNA聚合酶、线性DNA IVT）为例进行介绍。

1.1.1 线性DNA制备 目的DNA的获取可通过质粒或PCR制备［14］，因PCR法常导致产物中含有较多异常产物如不完整mRNA、聚合体等［15］，通常选择质粒而非PCR方法。完整制备mRNA用质粒DNA的设计应包含复制起始位点、启动子、5'UTR、ORF、3'UTR、多克隆位点、抗性基因等，多数情况下也含有多聚腺苷酸尾［poly（A）tail］编码序列。合成目的基因序列前，选择合适的5'、3'UTR编码序列以及poly（A）尾编码序列设计于目的基因两端，将有利于mRNA的稳定及表达。此外，在设计DNA序列时，常需对开放阅读框（open reading frame，ORF）中密码子进行分析优化以获得最适的编码效率。

1.1.1.1 UTR设计 合适的UTR序列设计，可显著增加mRNA的翻译效率。3'UTR常为不稳定因素富集区域，在设计时应避免不稳定序列，增加稳定序列的占比。稳定序列如AU、GU富集区可有效提高RNA稳定性，ORLANDINI等［16］研究表明，含稳定序列的3'UTR串联应用显著提高了mRNA稳定性及翻译效率。因α-珠蛋白或β-珠蛋白3'UTR中含有稳定的调节序列，常被用以设 计3'UTR［17］。5'UTR在mRNA翻译过程中至关重要，在翻译起始阶段，通过影响核糖体与mRNA的识别结合，从而影响mRNA的翻译效率，包括核糖体募集、扫描及起始密码子的选择。在设计mRNA 5'UTR时，避免与ORF 5'端具有相同的序列，可有效防止mRNA错误启动［18］；另外，可以在5'端序列中加入一些特有序列，如Kozak共有序列，可有效提高mRNA翻译准确度和稳定性［19］；其次，应考虑到5'UTR二级结构也会影响mRNA的翻译，往往较为松散的二级结构更加有利于mRNA的翻译［20］。

1.1.1.2 Poly（A）尾编码序列设计mRNA加尾与加帽一样，既可在转录前，也可在转录后。当选择转录前加尾时，需要在相应的DNA 3'UTR中设计poly（T）序列，poly（A）的长度会影响mRNA的翻译效率及稳定性，过长的poly（A）尾会降低翻译效率，过短的poly（A）尾会使mRNA不稳定，不同细胞中最适poly（A）长度各有不同，因此，要适当选择poly（A）的长度以达到使mRNA具备最大翻译效率和稳定性的目的［14］。

1.1.1.3 ORF编码区序列设计mRNA ORF区域中密码子的使用情况直接影响mRNA的翻译效率，mRNA高效率翻译并非均有益，一些蛋白需要相对较低的翻译速率才能使结构稳定，因此，需根据实际调整ORF中稀有密码子的使用频率来调节mRNA的翻译效率，以达到mRNA最佳的表达效果［21-22］。

1.1.1.4 目的DNA线性化 以质粒形式制备的DNA，应根据多克隆位点选取合适的限制酶进行线性化。因ⅡS类限制酶切割识别位点下游特点位置，其识别序列常被作为线性化位点设计。

1.1.2 mRNA前体转录合成mRNA体外转录技术已经较为成熟，噬菌体RNA聚合酶以构建的线性化DNA为模板，利用核苷酸和修饰核苷酸为原料，启动转录产生mRNA前体。目前使用的噬菌体RNA聚合酶较为流行的有T3、T7、SP6RNA聚合酶等［14］，其中以T7RNA聚合酶最常用。有研究发现，T7RNA聚合酶或其一种双突变体具有出色的非经典核糖核苷三磷酸（ribonucleoside triphosphate，rNTP）整合能力［23］，能够将s2U、5-甲基尿苷（m5U）、m5C、N6-甲基腺苷（m6A）以及假鸟苷（Ψ）整合至RNA中。

1.2 mRNA修饰

一般来说，在设计mRNA疫苗时应考虑到外源性mRNA会通过引起Ⅰ型干扰素、细胞因子等的产生，诱导机体对mRNA发生免疫排斥，从而明显降低治疗性基因药物的生效时长以及药物效果［24］。因此，采取一定的有效措施降低基因治疗产品的免疫原性是非常必要的；另外，自佐剂效应使得mRNA具有较强的免疫原性，会加强刺激机体产生类似排斥RNA病毒的免疫反应［25］，而帽结构和尾结构对于真核mRNA行使功能及稳定性至关重要［6，26］，因此还必须选择合适的方式添加帽结构和尾结构。

1.2.1 核苷修饰 已有研究证明，参入修饰核苷的mRNA能够有效抵抗RNA酶解作用［27］，并能够提高RNA翻译效率，增加稳定性［11］。尿嘧啶类似物是mRNA修饰中最常用的类似物，如将全部尿苷替换为假尿苷时，可明显提升翻译效率并降低免疫原性［28］，其他一些碱基类似物也可用于mRNA序列修饰。KORMANN等［28］和MAYS等［29］使用不同比率的m5C和s2U来修饰mRNA序列，均有效地降低了模式识别受体（pattern recognition receptor，PRR）的识别率，并提高了mRNA的胞内稳定性。

1.2.2 加帽及修饰mRNA 5'端帽子结构具有3种类型，分别为0、Ⅰ和Ⅱ型。0型帽子指末端核苷酸的核糖未甲基化，Ⅰ型指末端1个核苷酸的核糖甲基化，Ⅱ型指末端2个核苷酸的核糖均甲基化。2014年，KUMAR等［30］评估了模式识别受体识别3种不同方式加帽mRNA的能力，包括cap0、cap1以及非加帽mRNA，发现cap1加帽方式的mRNA在被模式识别受体识别后仍可翻译产生蛋白，而cap0和未加帽mRNA被模式识别受体识别后则不能翻译产生蛋白，对于Ⅱ型帽子结构的功能探索还较少，因此，选择合适的Ⅰ型加帽方式可避免因强免疫反应抑制mRNA的转译效率［31］。

mRNA加帽主要有2种方式：在转录前加入m7GpppG类似物完成封盖；在转录后使用加帽酶进行封盖［14］。由于常规的帽子类似物常导致形成mRNA异 构 体［32］，JEMIELITY等［33］和GRUDZIENNOGALSKA等［34］改进了一种抗逆转录帽类似物（anti-reverse cap analogs，ARCA），并发现其比常规加帽方式具有更高的翻译效率；KUHN等［35］研究显示，β-S-ARCA可显著增强未成熟树突状细胞（DC）中mRNA的稳定性和翻译效率。2016年，STRENKOWSKA等［36］合成了由1，2-二硫代二磷酸修饰ARCA和1个名为2S类似物的延长聚磷酸盐链组成的cap类似物，其优点是可使2S类似物的功能优于临床试验中使用的任何S-ARCA。2018年开发了另一种cap类似物，称为“CleanCap”的共转录加帽方法，是利用一种起始的封盖三聚体产生一种自然的5'端帽结构，加帽效率高至90%～99%［37］。相比之下，ARCA帽类似物常产生cap0结构的mRNA，且加帽效率较低，产生的cap0 mRNA表达效率也较低。

mRNA加帽修饰技术也一直在发展，包括共转录方法和转录后酶促2种方法。帽类似物共转录加帽，如2001年STEPINSKI等［32］开发的初代ARCA、2003年JEMIELITY等［33］改良的ARCA、2016年STRENKOWSKA等［36］改进的用1，2-二硫代二磷酸部分修饰的ARCA以及2018年VAIDYANATHAN等［37］开发的“CleanCap”等帽子结构类似物至今仍被应用；转录后加帽酶加帽，如1975年MARTIN等［38］开发的牛痘病毒加帽酶结合2'-O-甲基转移酶产生cap1也是一种良好的加帽策略。

1.2.3 加尾Poly（A）尾的存在对于mRNA稳定性以及细胞定位具有十分重要的作用，其可以延缓核酸酶对mRNA的降解作用，提高mRNA翻译效率［14］。多聚腺苷酸结合蛋白能够通过翻译起始因子结合5'端cap调节翻译效率，也能够结合腺苷酸复合物参与micro RNA介导的翻译抑制［39］，这种双重作用提示poly（A）尾的长度要适中，不能过长或过短。

与加帽方式一样，在转录前后均可增添尾结构。转录前加尾是通过在DNA模板中设计相应的poly（T）序列，从而使转录得到的mRNA直接具有特定长度的尾结构；转录后加尾是通过多聚A聚合酶在RNA尾部催化聚合腺苷酸以添加poly（A）结构。2种方式相比之下，转录前加尾似乎具有更多的优势，不仅能够更加准确地控制poly（A）长度，还减少了酶的使用及去除步骤；而多聚A聚合酶常产生不同长度poly（A）尾结构的mRNA混合物［6］。

2 mRNA纯化

mRNA合成过程中，需要对使用的酶、游离核苷酸、蛋白质、盐等进行清除；另外机体仍会对含修饰核苷mRNA产生低水平的免疫排斥，其可能的原因是修饰核苷未能完全抑制机体识别排斥mRNA或含有dsRNA等杂RNA污染等。已有研究证实，经噬菌体RNA聚合酶体外转录产生的mRNA，包含多种如转录中断产生的短RNA、RNA依赖性RNA聚合酶催化产生的dsRNA、T7RNA聚合酶催化产生的以RNA为模板的RNA引物延伸以及5'-末端、3'-末端异质性杂RNA［2-6］，高效的mRNA纯化不仅能够去除引起免疫排斥的杂RNA污染，还能够提高mRNA翻译效率［8］。常用的纯化方法包括：LiCl、乙醇、异丙醇沉淀；LiCl沉淀法结合离子对反相HPLC；芯珠树脂色谱结合切向流过滤［（tangential flow filtration，TFF）或超滤（ultrafiltration，UF）和透滤（dialysis filtration，DF）］等。

3 mRNA递送系统

mRNA不同于DNA，其稳定性更差，更易被环境中RNA酶降解，mRNA带有的负电荷使其与细胞膜相互排斥而不能有效进入胞内，且存在于血液等细胞外环境中的核酸酶能够快速降解mRNA，因此，高效的递送系统也是决定mRNA能否有效行使功能的因素之一。目前脂质纳米粒（lipid nanoparticle，LNP）是mRNA递送领域的重要成员，这一最初应用于小干扰RNA递送的介质，因其能够高效地传递并释放mRNA至胞内，有效保护mRNA不被降解，并能通过不同给药策略实现局部或全身表达，现已被广泛应用于mRNA的递送［40-43］。更为高效的递送系统、有效的修饰、优化策略等使得原本限制mRNA技术发展的问题，如天然免疫原性强、表达效率低、递送效果差等得到较大程度解决。目前存在的递送方式主要包括以下几种。

3.1 裸mRNA注射 即不将mRNA包装，而是直接注射至组织中，注射前通常需用缓冲液对mRNA进行一定的稀释处理，常用的缓冲液包括蔗糖、海藻糖溶液、林格溶液或乳酸林格溶液等。1990年，Wolff即通过裸注射的方法向小鼠体细胞内递送mRNA。有研究认为，其机制是外源性mRNA在巨噬细胞的作用下被DC摄取而获得表达［44］。这种裸注射递送方式的优点是成本低、方便快捷，缺点是裸mRNA极易被RNA酶降解，且难以穿过细胞膜。

3.2 体外DC负载 树突状细胞作为最强的抗原提呈细胞，被认为能够成为基因治疗药物的递送介质。常通过脂质衍生载体等具备更高效率的电穿孔法将mRNA介导入DC［45］。通过DC负载的mRNA常引起细胞免疫，因此常被用于癌症治疗［46］。但mRNA转染DC效率低，且制备过程中因耗时长常导致转染至DC中的mRNA引起的免疫应答消失，成本较高。

3.3 阳离子纳米乳（cationic nanoemulsion，CNE）是一种基于水包油的递送方式，由角鲨烯和表面活性剂如吐温、生育酚等组成，MF59和AS03是2种水包油乳剂佐剂，应用于2009年的流感疫苗研究中［47-48］。CNE中含有一种关键成分，即二油酰基-三甲基铵-丙烷（dioleoyl-trimethylammonium propane，DOTAP），其在油相中用于复合mRNA，可有效保护mRNA不受降解［49］。最近又开发出一种新的应用于新冠疫苗HGCO10的脂质无机纳米颗粒，正在进行临床试验，因嵌入超顺磁性氧化铁（Fe3O4）纳米颗粒（superparamagnetic iron oxide，SPIO）可实现治疗、成像、定点等功能，且稳定性好于前Moderna和辉瑞公司生产的2个新冠mRNA疫苗［50］。

3.4 阳离子肽和聚合物Curevac公司利用鱼精蛋白开发了狂犬和甲型流感的mRNA疫苗递送，鱼精蛋白富含精氨酸、赖氨酸等碱性氨基酸残基，能够与带有负电荷的mRNA复合使其稳定。然而由鱼精蛋白递送的mRNA疫苗临床翻译效果不佳［51］。其他阳离子聚合物如聚乙烯亚胺（polyethylenimine，PEI）、聚酰胺-胺［poly（amidoamine），PAMAM］等在递送方面也显示出一定作用，但其毒性和高多分散指数又使其具有很大的局限性［52］。

3.5 LNP 2018年，针对遗传性转甲状腺素蛋白淀粉样变性（hereditary transthyretin amyloidosis，ATTR amyloidosis）的小干扰RNA“patisiran”能够得到批准，很大程度上得益于LNP的配方改进［53］。LNP含有4种组分：阳离子可电离脂质、聚乙二醇（PEG）脂质、磷脂、胆固醇。阳离子可电离脂质是LNP中最重要的一种组分，其电离系数与胞内内体基本保持一致，不仅能够促进mRNA顺利包装至LNP中，还在胞内参与mRNA从内体中释放［54］；PEG脂质提供胶体稳定性，防止蛋白与纳米粒结合，从而减少网状内皮系统对LNP的清除作用，增加体循环时长；中性磷脂如二硬脂酰基卵磷脂（distearoyl-sn-glycero-phosphocholine，DSPC）和二棕榈酰磷脂酰胆碱（dipalmitoylphosphatidylcholine，DPPC），提供双层磷脂稳定性结构［55］；胆固醇提供刚性，提高LNP的硬度以及防止LNP成分泄露［56］。为达到最佳递送效果，各组分间的配比也十分重要，如2种针对新冠的疫苗BNT-162b2和mRNA-1273就使用了不同的组分比例［57］。

4 展望与总结

mRNA IVT使得可以在短时间内以低成本大量制备mRNA，经稳定的纯化，除mRNA IVT、mRNA修饰、纯化、递送技术的迭代优化外，DNA合成技术的最新进展使得编码任何潜在靶抗原的基因成为可能，这种大规模适合体外转录DNA模板的快速组装，也是mRNA药物技术的强有力的基础支撑［58］。基于mRNA的预防疫苗、治疗性疫苗以及基因治疗药物已经进行了较为广泛的研究。除针对新冠的mRNA疫苗外，mRNA-LNP先驱BioNTech和Moderna公司均已在多种实体瘤治疗（包括转移性黑色素瘤和侵袭性胰腺癌）的临床试验中通过使用个性化疫苗取得了一定进展（显示了抗肿瘤免疫），开创了治疗性癌症疫苗的新纪元［59］。

尽管在癌症疫苗和治疗性药物应用方面存在一些挑战，但随着新抗原、递送介质的发现、识别、开发，个性化癌症疫苗治疗和基因治疗药物的应用不断得到促进。mRNA编码的新抗原已成为个性化疫苗运动的领军者，如黑色素瘤、前列腺癌等一些mRNA癌症疫苗以及流感、结核等预防疫苗，均已进入临床阶段或临床前阶段；一些mRNA基因治疗药物也正在进行临床及临床前试验，如针对花粉、蛋清、尘螨过敏原的过敏耐受；针对尿崩症、贫血、哮喘等疾病的功能蛋白替代；另外，在基因编辑、组织工程、细胞基因重组等方面的mRNA应用也已进入临床前阶段［60］。

综上所述，mRNA是一个功能强大而用途广泛的药物、疫苗研发平台，临床上的成功应用预示着疾病治疗和预防新方向的可行性。未来，可通过串联蛋白编码序列，实现多价疫苗或“鸡尾酒效应”疾病治疗；对于细胞外转运、胞内逃逸以及表达机制调控均有实现的可能性；虽然个体差异始终存在，但mRNA药物引领的个性化治疗，必将呈现基因治疗领域的另一特色。另外，以LNP为基础的mRNA疫苗仍需进行大量研究，以了解LNP的结构、生物分布、毒性等，这种变革性的治疗方式在发达国家成药的实现，对全世界有着深刻的影响。此外，开发一种系统的、基于机制的方法研究理化降解途径，寻找更有效的赋形剂以及开发更稳定的制剂类型，提高内在稳定性，增强体内药效作用发挥，降低储存条件，也将是mRNA药物行业带动的另一些领域。