2015—2019年某焦化厂下风向居民血清免疫球蛋白分析

郭玉凤，孔晓娜，张 婷，张 超，薛振伟，李建军，张 晶，周小林*

(中国辐射防护研究院，国家环境保护环境与健康重点实验室，山西 太原 030006)

焦化生产过程中会产生大量包括多环芳烃(polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs)、苯 及 苯 系物在内的焦炉逸散物(coke oven emissions，COEs)[1-2]。PAHs已被国际癌症研究机构(International Agency for Research on Cancer，IARC)列入人类确定致癌物，属于Ⅰ类致癌物[3]。流行病学研究发现，PAHs暴露会造成免疫功能损伤，增加癌症风险[4]。此外，PAHs还具有免疫毒性和神经毒性[5]。当人体受到这些外部物质刺激后，免疫细胞合成特异性的抗体，即免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)，其中血清免疫球蛋白IgG、IgA和IgM是评价人体免疫功能最常用的指标[6]。本研究通过对长期居住在焦化厂下风向区域人群血清免疫球蛋白及尿中多环芳烃代谢物1-羟基芘连续5年(2015—2019年)的监测，探索低剂量PAHs等污染物长期暴露对人群免疫功能的影响，为其健康风险评价提供依据。

1 材料与方法

1.1 调查对象

2015—2019年夏季，按照一定的纳入排除标准选取中国北部某焦化厂(常年主导风向为北风)下风向1~2 km两个村庄的常住居民为研究对象，采用自制的问卷调查表对研究对象的姓名、性别、年龄、吸烟史、本地居住时间以及居住环境等进行调查。纳入标准：在本调查地区居住5年以上，近1个月内无传染病发作以及用药史者。排除标准：在本调查地区居住不满5年或有焦化厂职业暴露史，调查期间患有慢性病以及急性传染病者。本研究已通过中国辐射防护研究院附属医院伦理审查委员会审查，研究对象(包括儿童的监护人)均签署了知情同意书。

1.2 实验方法

1.2.1 主要仪器与试剂BS-400全自动生化分析仪购于深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司，Waters-2695高效液相色谱仪及Phenomenex ODS色谱柱(250 mm×4.6 mm，5μm)购于美国Waters公司，固相萃取仪购于美国色谱科公司，水浴氮吹仪购于上海乔跃 电子有限公司，BS4402高速离心机购于日本SANYO公司。

甲醇购于德国Merck公司，乙腈购于德国Fisher Scientific公司，β-葡聚糖醛酸酶购于德国Roche公司，盐酸、醋酸钠(分析纯)购于天津市风船化学试剂有限公司，1-羟基芘购于德国Dr.Ehrenstorfer GmbH公司。

1.2.2 血样采集和免疫球蛋白的检测收集研究对象空腹外周血约5 mL，4 000 r/min离心5 min，取上层血清置于1.5 mL离心管中，4℃保存，并在3 d内采用全自动生化分析仪检测IgG、IgA和IgM的含量(g/L)。各免疫指标的正常参考值范围分别为：IgA，0.70~5.0 g/L；IgG，7.0~16.0 g/L；IgM，男性为0.4~2.8 g/L，女性为0.4~2.3 g/L。

1.2.3 尿液收集和1-羟基芘的检测收集研究对象晨尿中段约30 mL，采用全自动生化分析仪检测尿肌酐(Cr)的含量(μmol/L)。取2 mL尿样、加入0.25 mL的0.1 mol/L盐酸、0.75 mL的0.5 mol/L醋酸钠-醋酸缓冲溶液(pH=5)和5μL的β-葡聚糖醛酸酶，37℃恒温水浴过夜。次日取出后，离心30 min，取2 mL上清液过固相萃取小柱，洗脱液于45℃氮气流下吹干，残渣用400μL甲醇复溶，离心取10μL上清液，采用高效液相色谱-荧光检测法检测1-羟基芘的含量，通过尿肌酐检测值进行校正，单位为μg/g，具体实验方法见参考文献[7]。

1.3 质量控制

检测人员熟练掌握检测方法，检测使用符合规定的检测器材。严格按照纳入排除标准选取研究对象，其血液收集均在晨起空腹状态下进行，采集后通过冷链运输，以保证检测质量。

1.4 统计学分析

利用SPSS 19.0统计学软件和OriginPro 2017绘图软件，男性与女性、成人与未成年人不同年份的血清免疫球蛋白(IgG、IgA和IgM)异常的人数占总人数的百分比即为异常率，异常率比较采用卡方检验。血清免疫球蛋白(IgG、IgA和IgM)含量采用均值、中位数(M)、最小值(Min)、最大值(Max)、第25位百分位数(P25)以及第75位百分位数(P75)描述数据特征；多环芳烃代谢物1-羟基芘水平采用均值、中位数(M)、第25位百分位数(P25)以及第75位百分位数(P75)描述数据特征；均值分布近似正态分布，采用t检验比较，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 基本情况

2015—2019年分别收集226、214、205、242和183名研究对象的外周血样本；232、232、215、183和179名研究对象的尿液样本。血液样本中成人平均年龄为(56.85±12.01)岁，未成年人的平均年龄为(10.46±2.23)岁。性别在各年份间差异无统计学意义(P=0.753)，年龄构成比在各年份间差异具有统计学意义(P＜0.05)，见表1。

表1 2015—2019年某焦化厂下风向居民血清免疫球蛋白样本量统计表

2.2 2015—2019年各年份间男性与女性血清免疫球蛋白含量数据特征分析

男性与女性血清免疫球蛋白IgG、IgA和IgM含量的数据特征见图1。其中女性血清IgG含量均值在各年份间均高于男性(P＜0.01)，IgM含量均值在2015年和2016年高于男性(P＜0.05)，见表2。

图1 2015—2019年某焦化厂下风向居民男性与女性血清免疫球蛋白含量数据特征图

表2 2015—2019年某焦化厂下风向居民各年份男性与女性血清免疫球蛋白含量比较(x±s，g/L)

2.3 2015—2019年各年份间成人与未成年人血清免疫球蛋白含量数据特征分析

成人与未成年人血清免疫球蛋白IgG、IgA和IgM含量的数据特征见图2。其中成人血清IgG和IgA含量均值在各年份间均高于未成年人(P＜0.01)，IgM含量均值在2016年低于未成年人(P＜0.01)，见表3。

2.4 2015—2019年某焦化厂下风向居民血清免疫球蛋白IgG含量异常率分析

2015—2019年，该地区居民血清免疫球蛋白IgG含量异常率变化见表4，其中未成年人血清IgG含量异常率变化具有统计学意义(P＜0.01)。2015年和2016年，血清IgG含量异常率男性与女性之间，成人与未成年人之间IgG含量异常率差异较大(P＜0.05)。

图2 2015—2019年某焦化厂下风向居民成人与未成年人血清免疫球蛋白含量数据特征图

表3 2015—2019年某焦化厂下风向居民各年份成人与未成年人血清免疫球蛋白含量比较(x±s，g/L)

表4 2015—2019年某焦化厂下风向居民血清免疫球蛋白IgG含量异常率比较(%)

2.5 2015—2019年某焦化厂下风向居民血清免疫球蛋白IgA含量异常率分析

2015—2019年，该地区居民血清免疫球蛋白IgA含量异常率变化见表5，其中女性、未成年人及总体血清IgA含量异常率差异具有统计学意义(P＜0.05)。2016年成人血清IgA含量异常率明显高于未成年人(P＜0.05)，其余各年份男性与女性、成人与未成年人之间IgA含量异常率差异无统计学意义(P＞0.05)。

表5 2015—2019年某焦化厂下风向居民血清免疫球蛋白IgA含量异常率比较(%)

2.6 2015—2019年某焦化厂下风向居民血清免疫球蛋白IgM含量异常率分析

2015—2019年，该地区居民血清免疫球蛋白IgM含量异常率变化见表6，不同组别的血清IgM含量异常率变化均有统计学意义(P＜0.01)。各年份男性与女性居民IgM含量异常率差异无统计学意义(P＞0.05)。2016年和2017年成人IgM含量异常率高于未成年人(P＜0.05)。

表6 2015—2019年某焦化厂下风向居民血清免疫球蛋白IgM含量异常率比较(%)

2.7 2015—2019年某焦化厂下风向居民尿中多环芳烃代谢产物1-羟基芘检出情况分析

由1-羟基芘标准样品制作的标准曲线线性良好，线性度R为0.999 8~1.000 0；待测物回收率为71.95%~117.15%。方法的日间精密度和日内精密度除个别离群数值外均＜10%。2015—2019年，该地区居民尿中多环芳烃代谢产物1-羟基芘的检出水平中位数分别为0.468、0.797、0.678、0.169和0.021μg/g，总体呈现先上升后下降的趋势，见表7。

表7 2015—2019年某焦化厂下风向居民尿液代谢产物1-羟基芘检出情况

3 讨论

焦化生产过程中会产生大量成分复杂的焦炉逸散物，孙冬雪等[8]对焦炉逸散物进行风险评估发现其存在高度致癌风险。焦炉逸散物对人体健康的危害涉及肺癌、急慢性皮炎、皮肤癌、CO中毒等[9]。此外，研究发现焦炉逸散物会降低人体红细胞免疫及调节功能，从而损害机体免疫功能[10]。其中多环芳烃(PAHs)广泛分布于大气、土壤及水体等环境中，由于其毒性、致癌性、生物蓄积性和半挥发性使其能在环境中持久存在，被列入典型持久性有机污染物[5]。烟煤、石油、木材、烟草、有机高分子化合物等有机物不完全燃烧也会产生PAHs，包括机动车辆、家庭炉灶等，可通过呼吸、皮肤以及饮食等途径进入人体[11]。随后通过人体代谢形成羟基多环芳烃，以葡萄糖醛酸、硫磺酸结合物的形式主要经尿液排出体外[12]。

PAHs是已知的具有显著免疫毒性的环境因子，研究发现，PAHs及其代谢物通过诱导人体肺泡和支气管细胞的DNA氧化损伤发挥毒性作用[13]。PAHs和苯混合接触可导致焦炉作业工人一定程度的血象改变和淋巴细胞DNA损伤[1]。此外，PAHs是免疫抑制类物质，长期暴露可降低干扰素(interferon，IFN-γ)等抗肿瘤免疫细胞因子的表达，从而引起免疫功能损伤[3，14]。

血清免疫球蛋白是反映机体免疫功能的重要指标，免疫调节功能发生紊乱会使免疫球蛋白的含量发生不同程度的变化[15]。当免疫球蛋白结构改变或含量明显改变时均产生病理变化，因此，检测血清免疫球蛋白有助于了解人体免疫作用。免疫球蛋白主要包括IgG、IgA、IgM、IgD以及IgE，其中IgD和IgE含量极低，常以检测IgG、IgA和IgM含量为主[16]。其中，IgM参与初次免疫应答，其功能是凝集病原体并激活补体；IgG是再次免疫应答抗体，参与特异性免疫；IgA参与人体黏膜感染过程，免疫力较高，在健康人血清中含量相对稳定[16-17]。研究发现，肺癌、胃癌、肠癌、肝癌等恶性肿瘤会导致血清免疫球蛋白IgG、IgA和IgM含量不同程度的增加[15-17]。

人体对PAHs的暴露水平可通过生物标志物来综合评价，即检测人体组织或体液中的PAHs或其代谢产物，其中尿中多环芳烃的代谢产物(主要为羟基代谢产物)是研究最多的生物标志物，其中1-羟基芘是体内主要的代谢产物。荷兰Jongeneelen等[18]最先将1-羟基芘作为人体环境暴露PAHs的生物标志物，随后，更多的研究证明尿中其是一个有效、可靠的内暴露指标[12，18]。本次调查人群来自某焦化厂附近，常年居住在该焦化厂主导风向(北风)的下风向，流行病学调查和样品采集均在夏季进行，因冬季取暖或饮食暴露多环芳烃的影响较小，主要暴露来源于工厂废气排放。

研究发现，免疫球蛋白IgG、IgA，在＜1岁时含量最少，随着年龄的增大含量逐渐增加而接近成人水平，免疫球蛋白IgM，在＜1岁时含量最少，到3岁时可达到成人水平，而后含量又缓慢增加并超过成人，最后逐渐降到成人水平，而成人男女之间IgG、IgA和IgM含量无明显差异[19]。本研究结果显示，2015—2019年焦化厂下风向居民成人血清免疫球蛋白IgG和IgA含量均值均高于未成年人(P＜0.01)，而血清IgM含量均值在2016年明显低于未成年人(P＜0.01)，但是女性血清IgG含量均值在各年份间均高于男性(P＜0.01)，IgM含量均值在2015年和2016年高于男性(P＜0.05)，推测这可能与该地区污染情况有关，但是具体原因有待进一步统计分析。同时，2015—2019年不同年份间血清免疫球蛋白(IgG、IgA和IgM)含量异常率总体呈现先上升后下降的趋势。近年来，国家出台了一系列的环境与健康相关文件[20-21]。Jongeneelee等[18]建议非职业暴露非吸烟人群中1-羟基芘的生物暴露限值为0.46 μg/g Cr。非污染区居民尿中1-羟基芘的检出率均较低或未检出[7]。本研究结果显示2015—2019年焦化厂下风向居民尿中1-羟基芘含量呈现先上升后下降的趋势，与血清免疫球蛋白(IgG、IgA和IgM)含量异常率变化趋势一致，且2016年成人与未成年人血清IgG、IgA和IgM含量异常率差异较大(P＜0.05)，推测该地区居民血清免疫球蛋白(IgG、IgA和IgM)含量变化在一定程度上受焦化厂排放多环芳烃的影响。此外，本研究调查对象多为中老年人(45~59岁，60~74岁和75~89岁人群分别占成人总数的34.20%，46.97%和2.92%)，机体抵抗力和免疫力下降，受环境污染影响较大。此外，研究发现，焦炉逸散物所致肺癌一般有9~23年的潜伏期，患者年龄偏大，平均年龄在60岁左右[22-25]。

综上所述，2015—2019年焦化厂下风向居民尿中1-羟基芘及血清免疫球蛋白(IgG、IgA和IgM)含量异常率总体皆呈现先上升后下降的趋势，含量均值具有一定的性别差异和年龄差异。本研究存在的不足在于研究对象样本量较小，缺乏环境监测数据，且本研究仅以一种多环芳烃代谢物1-羟基芘为指标，对于检测出的其他代谢产物并未进行分析，具有一定的局限性。目前，多环芳烃对免疫系统的危害作用机制尚未明确，尚缺乏长时间、低剂量暴露的剂量-反应关系的研究。本研究结果仅可为阐明长期生活在焦化环境污染区居民早期健康损伤效应监测提供依据。