基于尿液代谢组学研究青蒿琥酯对庆大霉素诱导犬急性肾功能衰竭的保护机制

朱道仙 陆江 郝福星 吴植

摘要：为观察青蒿琥酯对庆大霉素诱导犬急性肾功能衰竭尿液代谢物的调节作用及其机制。将24只泰迪型贵宾犬，随机等分为3组：对照组（control组）、肾衰组（CRF组）和青蒿琥酯组（ART组）。除对照组，其他组犬采用注射庆大霉素建立急性肾功能衰竭模型。然后，ART组给予青蒿琥酯，对照组和CRF组给予相同体积生理盐水。用生化分析仪测定肌酐（Cr）和尿素氮含量，用气相色谱-质谱法（GC-MS）测定尿液中的代谢物水平。结果显示，与CRF组比较，ART组血清Cr和尿素氮含量极显著降低（P<0.01）;共有14种代谢物水平发生改变，其中，α-酮戊二酸、色氨酸、酪氨酸、琥珀酸、花生四烯酸、苹果酸、柠檬酸及棕榈酸等含量降低;葡萄糖酸、牛磺酸、甘氨酸、肌酐、丝氨酸及甘油等含量升高。代谢通路分析发现共涉及三羧酸循环、甘氨酸代谢、酪氨酸代谢、色氨酸生物合成、谷胱甘肽代谢、甘油磷脂代谢及不饱和脂肪酸生物合成等7条代谢途径。以上结果表明，青蒿琥酯可有效改善庆大霉素诱导犬急性肾功能衰竭，可能与调节脂代谢、氨基酸代谢和能量代谢等通路有关。

关键词：青蒿琥酯;庆大霉素;犬;急性肾功能衰竭;尿液代谢组学;代谢通路

中圖分类号：S858.292   文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2022）02-0137-05

收稿日期：2021-05-07

基金项目：江苏现代农业产业技术体系建设项目（编号：JATS[2018]238）;江苏农牧科技职业学院校级课题（编号：NSF201706）。

作者简介：朱道仙（1978—），女，安徽寿县人，硕士，讲师，主要从事动物临床营养及代谢病研究。E-mail：331802901@qq.com。

通信作者：陆 江，硕士，副教授，主要从事动物临床营养及代谢病研究。E-mail：vetlj@163.com。

犬的急性肾功能衰竭是由多种病因引起的肾功能快速下降而出现的以氮质血症为特征的一种临床综合征，近年发病率逐渐升高。目前，常采取对症治疗、纠正酸碱平衡紊乱、维持残肾功能等方法进行治疗，效果不一，部分动物病情恶化甚至死亡，尚无有效的治疗方法。研究报道，对急性肾功能衰竭进行早期干预可降低肾功能进一步恶化的风险[1-2]。青蒿琥酯（artesunate，ART）具有抗氧化应激、抗炎、抗肿瘤及免疫调节等作用[3]。大量研究表明，ART对多种原因引起的肾损伤具有保护作用[4-5]，然而其作用机制尚不明确。代谢组学是研究细胞、组织、器官或整个生命有机体代谢物（相对分子质量在1 000以下）的组成及这些代谢产物在内外因素刺激下动态变化的一门科学[6]。由于代谢组学侧重于反映生物体内真实的病理生理变化状态，对药物干预后的作用趋势具有指导意义，目前代谢组学技术已在各系统疾病的研究中广泛应用[7]。因此，本研究拟采用气相色谱-质谱法（GC-MS）的尿液代谢组学检测方法，探讨青蒿琥酯对庆大霉素诱导急性肾功能衰竭模型犬的干预作用，以期阐明青蒿琥酯防治犬急性肾衰竭的作用机制。

1 材料与方法

1.1 试验动物

泰迪型贵宾犬，约4岁，体质量（7±1） kg，雄性，江苏农牧科技职业学院宠物美容犬房提供。

1.2 试验设计

于2020年5月，选取24只泰迪型贵宾犬饲养于江苏农牧科技职业学院实验动物房，随机等分为3组：对照组（control组）、肾衰组（CRF组）和青蒿琥酯组（ART组）。所有犬均以商品化成年犬粮（冠能成年犬犬粮，规格12 kg/袋，雀巢普瑞纳宠物食品有限公司）进行7 d适应性饲喂后，除对照组，其他各组犬参考张萍等的方法[8]，每天09：00按照 40 mg/kg 体质量肌肉注射硫酸庆大霉素注射液（购于天津药业焦作有限公司），连续注射5 d，若血清肌酐（Cr）含量及临床症状无明显变化，则按 40 mg/kg 体质量间隔12 h重复给药，直至Cr含量>270 μmol/L，尿素氮含量升高，停止用药，犬急性肾衰模型建立成功。对照组给予等量生理盐水作为对照。然后，ART组犬按1 mg/kg体质量肌肉注射青蒿琥酯注射液（购于哈尔滨市宏达动物药品厂），CRF组和Control组给予等量生理盐水，1次/d，连续5 d。

1.3 血液肾功能指标测定

分别于慢性肾衰造模前（0 d）、造模后（7 d）和试验结束（12 d）时的08：00，空腹经头静脉采集各组试验犬的血液并制备血清，用M149928-全自动干式生化分析仪测定血清肌酐和尿素氮含量。

1.4 GC-MS法检测尿液代谢物

1.4.1 尿液采集 试验结束时，经膀胱穿刺收集新鲜尿液后迅速置于-80  ℃保存，待测。

1.4.2 尿样处理 参考孟欣等的方法[9]，将“1.4.1”节保存的尿液室温下融化后，4 ℃、12 000 r/min 离心15 min后取上清液。取上清液200 μL，加入20 μL脲酶，混合均匀于37 ℃培养箱中孵化反应 20 min，加入 800 μL 冰冷色谱级乙醇，4 ℃、12 000 r/min 离心 15 min，吸取200 μL上清液转入高回收率玻璃衍生小瓶中，采用温和氮气吹干提取液。向干燥物中加入30 μL 20 mg/mL盐酸甲氧胺吡啶溶液，37 ℃肟化反应90 min。取出后继续加入30 μL N，O-双（三甲基硅基）三氟乙酰胺（含1%三甲基一氯硅烷）的衍生试剂，密闭并于 70 ℃ 反应60 min。取出样本，室温放置30 min，进行GC-MS代谢组学分析。

1.4.3 GC-MS反应条件 GC-MS试验的仪器分析平台为安捷伦7890A/5975C GC-MS系统，毛细管色谱柱为Agilent J&W Scientific公司的 HP-5 ms（30 m×0.25 mm×0.25 μm）。程序升温条件：初始柱温60 ℃，保留1 min，以20 ℃/min升温至320 ℃，保留4 min。进样口温度250 ℃，四极杆温度150 ℃，高纯氦气作为载气，不分流进样，进样量1.0 μL。质谱条件：电离方式EI，碰撞能量为70 eV，离子源温度280 ℃，离子传输线温度250 ℃，溶剂延迟时间为4 min，扫描方式为全扫描，质谱检测范围为50～600质荷比（m/z）。

1.5 数据处理

计量资料采用“平均值±标准差”表示，采用SPSS 22.0统计软件ANOVA程序单因素方差分析（one-way ANOVA），并進行多重比较（LSD）组间两两比较，同组不同时间点数据用重复测量数据资料方差分析比较。GC-MS所得的样品数据通过m/z识别、匹配和归一化等计算过程，得到矩阵，将其导入SIMCA-P 12.0软件中进行主成分分析（PCA），及偏最小二乘判别分析（PLS-DA），采用MetaboAnalyst网站（http：//www.metaboanalyst.ca/）进行代谢物的代谢通路富集分析。

2 结果与分析

2.1 肾功能指标的变化

由图1-a可知，7 d，CRF组和ART血中Cr浓度升高，超出生理阈值（红色虚线），约为对照组的2.5倍;12 d，与CRF组比较，ART组Cr含量极显著降低（P<0.01），与对照组比较，CRF组Cr含量极显著升高（P<0.01）。由图1-b可知，7 d，CRF组和ART血中尿素氮浓度升高，约为对照组的4倍;12 d，与CRF组比较，ART组尿素氮浓度极显著降低（P<0.01）;与对照组比较，CRF组尿素氮浓度极显著升高（P<0.01）。提示ART处理可以改善CRF模型犬的肾功能。

2.2 尿液代谢物的GC-MS总离子流图的变化

对所有样本的总离子流色谱图进行可视化检查，显示所有样本的仪器分析具有信号强、峰容量大且保留时间重现性好等特点。各组以其中1个样本的总离子流色谱图为代表，由图2可知，不同组间的总离子流色谱图有较大差异。

2.3 多元分析组间差异

在Simca-P 11.0软件中，采用默认的UV格式化（unit variance scaling）和平均中心（mean-centered）处理，对各组代谢物进行主成分分析（PCA），PCA得分图（scores plot）见图3-a，横坐标为第1主成分得分，用t[1]表示;纵坐标为第2主成分得分，用t[2]表示，所有样本处于95%置信区间（hotelling T2 ellipse）外，无异常样本，PCA第1主成分（R2X1）与第2主成分（R2X2）总累积解释率47.04%，为各组间的样本点完全分离，各组内样本点聚集较好。与CRF组比较，ART有向对照组回调趋势。采用PLS-DA的多维统计分析方法分别对3组样本进行模型分析，由图3-b可知，累积解释率为75.53%，说明3组样本间具有显著代谢差异。对PLS-DA分析模式随机置换200次，进行置换检测， R2=0.512， Q2=-0.056 8，提示本模型均有较好的稳定性及可预测性且不存在过拟合现象，模型建立成功，见图3-c。

2.4 差异代谢物筛选

由图4-a可知，采用PLS-DA模型第1主成分得到VIP（variable importance in the projection）值（VIP>1）、t检验P值（P<0.05），并结合变化倍数log2（差异倍数）>4来寻找差异性代谢物。将潜在差异代谢物的二级谱图与Metlin、HMDB及KEGG等数据库进行比对。与对照组比较，CRF组有16种差异代谢物，其中甘油、甘氨酸、肌酐、丝氨酸、3-吲哚硫酸及牛磺酸等含量下降;α-酮戊二酸、肌醇、色氨酸、酪氨酸、琥珀酸、苹果酸、花生四烯酸、苹果酸、柠檬酸及棕榈酸等含量升高。由图4-b可知，与CRF组比较，ART组有14种差异代谢物，其中，α-酮戊二酸、色氨酸、酪氨酸、琥珀酸、花生四烯酸、苹果酸、柠檬酸及棕榈酸等含量降低;葡萄糖酸、牛磺酸、甘氨酸、肌酐、丝氨酸及甘油等含量升高。

2.5 差异代谢物代谢途径富集分析

由图5可知，共有7条潜在代谢靶标途径可能参与CRF发生和ART干预，分别为三羧酸循环、甘氨酸代谢、酪氨酸代谢、色氨酸生物合成、谷胱甘肽代谢、甘油磷脂代谢及不饱和脂肪酸生物合成。说明CRF组犬体内代谢紊乱主要与脂代谢、氨基酸代谢和能量代谢等通路有关，经ART干预后部分代谢物出现回调趋势，提示代谢通路的紊乱得到相应调节。

3 讨论与结论

本试验使用硫酸庆大霉素诱导犬急性肾衰竭模型，以血液Cr浓度增加至参考值上限的50%为犬急性肾功能衰竭模型建造成功的标准[8]，成功诱导犬急性肾衰竭模型，试验犬无死亡且易于观察。造模7 d，血清Cr浓度约为对照组2.5倍，尿素氮浓度约为对照组4倍，证明了犬急性肾衰竭模型复制成功。给予ART治疗后，血清Cr和尿素氮浓度等指标均有所改善，说明ART对犬急性肾衰竭具有良好的治疗作用。

代谢组学技术是用于考察生物体受到刺激（药物或环境等）后，其代谢产物发生的动态变化，从而分析生物体生理病理状态，从整体上反映生物体的变化状态，避免了以往单一或少数指标研究病理生理变化[10]。GC-MS技术具有分离效果好、分辨度和检测灵敏度较高，有参考比较的标准图谱等优点，且尿液样本容易采集，对动物无损伤[11-13]。因此，本研究采用尿液进行GC-MS分析。

对尿液中代谢物进行差异分析发现，CRF组甘氨酸、肌酐及牛磺酸等含量低于对照组。徐婷婷等[14]在商陆致大鼠肾损伤的代谢组学研究中，发现尿液肌酐含量降低，与本结果研究一致。尿中肌酐含量降低，结合血清肌酐含量及尿素氮含量升高，进一步提示CRF的发生。在线粒体中进行的三羧酸循环是机体提供能量的主要方式，α-酮戊二酸、琥珀酸、苹果酸及柠檬酸等物质是其重要的中间产物。本研究结果显示，CRF组尿中这些物质含量高于对照组，提示急性肾衰竭时三羧酸循环发生异常，也间接反映线粒体功能的失调，而线粒体损伤是导致氧化应激的重要因素。给予青蒿琥酯（ART组）后可使α-酮戊二酸、琥珀酸、苹果酸及柠檬酸等含量回调，说明ART组改善了CRF组患犬三羧酸循环的状态。甘氨酸作为一种抗氧化剂，可调控脂质过氧化产物丙二醛（MDA）和氧化亚氮水平[15]。牛磺酸具有抗氧化、抗细胞凋亡、调节内质网应激反应、促线粒体蛋白质合成、维持渗透平衡等功能从而达到保护细胞膜的目的[16-17]。CRF组甘氨酸和牛磺酸含量降低，说明机体抗氧化能力减弱，发生氧化应激反应。连续给予青蒿琥酯后甘氨酸、牛磺酸及肌酐含量均显著回调，而且谷胱甘肽代谢通路改善显著，表明青蒿琥酯可提高抗氧化物质含量，改善机体氧化应激。提示抑制氧化应激可能是青蒿琥酯对庆大霉素诱导犬肾衰发挥保护作用的主要机制之一。此外，与炎症有关的代谢物花生四烯酸和棕榈酸[18-19]，在庆大霉素诱导肾衰竭犬的尿液中含量升高，而给予青蒿琥酯治疗后降低，这说明青蒿琥酯可以改善庆大霉素诱导肾衰竭时发生的炎症反应。

综上所述，庆大霉素诱导犬肾衰竭后体内一系列代谢途径发生紊乱和代谢物发生改变，而给予青蒿琥酯干预后，肾衰竭犬的肾功能得到改善，可能与青蒿琥酯调节体内脂代谢、氨基酸代谢和能量代谢等通路有关。

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